Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales
- Cultive ratones hembra C57BL6/J hasta las 8 semanas de edad en jaulas ventiladas individualmente con filtros de microaislamiento.
NOTA: Se prefieren las mujeres porque la conformación anatómica de su aparato urogenital externo facilita el cateterismo que en los hombres.
>2. Cultivo celular
- Mantener la línea celular de carcinoma urotelial de ratón MB49 en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% y 50 μg/ml de gentamicina a 37 °C en dióxido de carbono (CO2) humidificado al 5%.
- Cultive células MB49 en matraces T-75 hasta una confluencia del 80%. Tripsinizar y resuspender a 0,5 ×10 5 - 0,5 × 106 células por 150 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la implantación en ratones.
>3. Implante Tumoral Intravesical
- Anestesiar ratones utilizando una mezcla de los anestésicos zoletil y xylor (33 mg/kg y 20 mg/kg, respectivamente), inyectados por vía intraperitoneal.
- Coloque a los animales en posición supina y fije las patas traseras a la almohadilla con cinta adhesiva. Las patas deben estar lo suficientemente separadas para que el meato uretral sea bien visible y fácilmente accesible para la inserción del catéter.
- NOTA: Para el cateterismo, un catéter venoso pediátrico de 24 G es adecuado para ratones de 8 a 10 semanas de edad. La elección del catéter es fundamental para evitar fugas de líquido entre la pared uretral y el catéter. Se deben usar catéteres de mayor diámetro para ratones más grandes o viejos.
- Con una pinza pequeña, pellizque un borde de la parte externa de la uretra y gírelo muy suavemente hacia el "extremo de la cabeza" de los ratones. Esta acción expone el meato uretral.
- Retire la aguja interna del catéter e inserte este último en la uretra en un ángulo de 45°, ligeramente orientado hacia el "extremo de la cola" de los ratones. No fuerce la entrada del catéter; En caso de resistencia, basta con girar el catéter muy suavemente hasta que se deslice dentro de la uretra. Cuando aproximadamente 0,5-0,8 cm del catéter esté en la uretra, coloque con cuidado el catéter paralelo a la cola de los ratones e insértelo completamente.
- Con una jeringa de 1 ml, cuya aguja debe insertarse en el catéter, lave la vejiga de la orina residual inyectando 200-300 μl de PBS estéril y aspire todo el líquido de la vejiga.
- NOTA: Al inyectar PBS, la vejiga se llenará y la hinchazón será visible entre las patas traseras de los ratones, lo que confirma que el cateterismo es correcto. La mayoría de los catéteres tienen un volumen muerto que debe tenerse en cuenta a la hora de calcular el volumen de inyección.
- Con una jeringa estéril de 1 ml, inyecte 200 μl de ácido clorhídrico (HCl) 0,1 N. Llena la vejiga para quemar toda su pared. Después de 10 segundos, retire todo el ácido y neutralice inmediatamente inyectando 200 μl de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N con una jeringa estéril. En el caso de la inyección del mayor número de células (0,5 × 106), no es necesaria la etapa de acidificación.
- Aspire todo el líquido residual y enjuague inmediatamente la cavidad con 300 μl de PBS estéril.
- Vacíe la vejiga por aspiración e inyecte 150 μl de PBS que contenga células MB49 (rango 0,5 × 105 - 0,5 × 106) en la vejiga. Deje la jeringa ensamblada en el catéter para evitar la fuga de células. Es mejor asegurar la jeringa fijándola a la almohadilla con cinta adhesiva.
- Después de 1 hora, extraiga suavemente el catéter de la uretra y coloque a los ratones en la jaula bajo una lámpara incandescente hasta que se despierten: esto suele ocurrir entre 1 y 2 horas después del final del tratamiento.
>4. Administración intravesical de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori (HP-NAP)
- NOTA: Al menos 3 días después de la instilación celular, es posible comenzar el tratamiento.
- Cateterizar como se describe en los pasos 3.1 a 3.4. En esta etapa, no es necesario quemar la pared de la vejiga con HCl.
- Con una jeringa de 1 ml, lave la vejiga de la orina residual inyectando 200-300 μl de PBS estéril y aspire todo el líquido de la vejiga.
- Inyecte 50 μg de HP-NAP por cada 150 μl de PBS en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar fugas de la solución proteica. Asegure la jeringa fijándola a la almohadilla con cinta adhesiva.
- Después de 1 hora, extraiga suavemente el catéter de la uretra y coloque a los ratones en la jaula bajo una lámpara incandescente hasta que se despierten.
