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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el local
el comité institucional de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE. Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.
1. Generación de linfocitos T CD8+ específicos de Ag viral a partir de iPSCs (linfocitos T iPSC-CD8+)
- Creación de las construcciones retrovirales
nota: Los genes α y β del receptor de células T (TCR) están relacionados con la secuencia de autoescisión 2A. El vector retroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) es DsRed+.
- Los genes TCR (s183 TCR) híbridos humanos-murinos restringidos por A2 específicos de HBs183-191 (FLLTRILTI) (Vα34 y Vβ28) en el MiDR para crear la construcción de MiDR s183 (Figura 1A).
- Transducción retroviral
NOTA: Las células de platino-E (Plat-E) se utilizan para empaquetar retrovirus (portadores de genes s183 TCR), que se utilizarán para la transducción retroviral. Las células Plat-E son células de empaquetamiento de retrovirus efectivas subyacentes a las células 293T, que se desarrollaron mediante construcciones de empaquetamiento únicas a través del promotor EF1α para expresar proteínas de estructura retroviral, incluidas gag, pol y ecotropic env.
- En una placa de cultivo de 100 mm, siembre 3 x 106 células Plat-E en 8 mL de medio de cultivo DMEM que contenga un 10% de suero fetal de ternero (FCS) en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2, 1 día antes de la transfección.
- En el día 0, transfecte la construcción MiDR s183 en las células Plat-E utilizando un reactivo de transfección de ADN.
- El día 1, siembre 1 x 106 iPSC (proteína fluorescente verde [GFP]+) en una placa de cultivo prerrecubierta de gelatina.
- En los días 2 y 3, recoja el sobrenadante que contenga retrovirus del cultivo celular Plat-E para transducir iPSC con el s183 TCR en presencia de una solución de 1,6-dibromohexano.
- El día 4, tripsinícese las iPSC transducidas por el gen s183 TCR, centrifugue a 400 x g durante 5 minutos y siembre 3 × 105 iPSC en una placa de cultivo de 100 mm prerrecubierta con 3 x 106 6 celdas alimentadoras SNL76/7 (irSNL76/7) irradiadas.
- En el día 5 o 6 de la confluencia, tripsinar las células, centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y procesar para la clasificación de las células. Con activación de células vivas, clasifique las células GFP y DsRED dobles positivas (las iPSC transducidas por el gen s183 TCR) utilizando un clasificador de células de alta velocidad. De forma similar al paso 1.2.5, co-cultivo de las células clasificadas en las celdas alimentadoras irSNL76/7 para su uso futuro.
- Diferenciación de linfocitos T iPSC-CD8+ específicos del VHB
NOTA: Las células estromales OP9-DL1/DL4 sobreexpresan los ligandos Notch DL1 y DL4, y el cocultivo de iPSCs con las iPSCs puede promover la diferenciación de las células T mediada por la señalización de Notch.
- Cultive iPSC transducidas por el gen s183 TCR (s183/iPSC) en la monocapa celular OP9-DL1-DL4 en medios de medio esencial mínimo (MEM) de α que contenga un 20 % de suero fetal bovino (FBS). Incluir el ligando murino de tirosina quinasa 3 (Flt3) similar a FMS (mFlt-3L; concentración final = 5 ng/mL) en el cultivo.
- En el día 0, siembre 0,5–1,0 x 105 S183/iPSCs en una placa de cultivo de 10 cm previamente cultivada con células OP9-DL1-DL4. Valide que las células OP9-DL1-DL4 se encuentran en una condición de confluencia del 80 % al 90 %.
- El día 5, enjuague las iPSC con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), aspire el PBS, agregue esto a 4 mL de tripsina al 0,25% e incube en una incubadora a 37 °C durante 10 min. Después, agregue 8 mL suplementarios de medio iPSC para finalizar la digestión con tripsina. Acumular todas las soluciones digestivas que contienen las células y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 15–30 °C.
- Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mL de medio iPSC. Transfiera la suspensión celular a una nueva placa de Petri de 10 cm e incube en una incubadora durante 30 minutos a 37 °C.
- Después de 30 minutos, recoja los medios iPSC que contienen las celdas flotantes. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm y calcule el número de celdas.
- Siembre 5 x 105 células en la placa de cultivo células OP9-DL1-DL4 previamente cultivadas con una condición de 80%-90% confluentes, como se describe en el paso 1.3.1.
nota: Para la diferenciación de los linfocitos T, cada 2-3 días, las células derivadas de iPSC necesitan volver a sembrarse con una nueva capa de las células OP9-DL1-DL4.
- evaluación
- Cambios morfológicos de las iPSCs diferenciadoras
- Observe las células bajo un microscopio en varios días.
nota: Para el día 5, las colonias tienen características similares a las del mesodermo, exhibiendo una morfología clásica en forma de huso que se asemeja a los fibroblastos dérmicos humanos y un crecimiento sostenido in vitro. Para el día 8, comienzan a aparecer pequeños grupos redondos de células.
- Análisis de la diferenciación de iPSCs por citometría de flujo
- En varios días de cocultivo, analice las células derivadas de iPSC como se describió anteriormente (Figura 1B, C).
- Análisis funcional de la diferenciación de iPSCs
- En el día 28 del cocultivo, recoja las células T iPSC-CD8+ de los cultivos mediante la recolección de las células flotantes, tripsinícese las células sobrantes con tripsina al 0,25 %, vuelva a suspender en 8 ml de medio iPSC, centrifugue durante 5 min a 400 x g a 15-30 °C, retire el medio y luego vuelva a suspender las células en 10 ml de medio.
- Mantenga las células resuspendidas en un plato fresco de 10 cm en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos y ensamble las células flotantes. A continuación, enjuague las células una vez con un PBS frío.
- Incubar 3 x 106 esplenocitos con depleción de células T (CD4-CD8-) de bazos de ratones HLA-A2.1-transgénicos (HHD) knockout de clase I H-2 con 5 μM de péptido s183 (FLLTRILTI) en 200 μL de medio a 4 °C durante 30 min.
- Producir una mezcla de linfocitos T iPSC-CD8+ con esplenocitos pulsados con péptido s183 (linfocitos T: esplenocitos = 1:4; utilizar 0,75 x 106 linfocitos T). Incubar la mezcla de células a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 40 h. Durante las últimas 7 h, añadir 4 μL de brefeldina A diluida en el cultivo (concentración final de 1.000x, que se diluirá en 1x medio de cultivo) para bloquear los procesos de transporte durante la activación celular.
- Tiñir las células y realizar un análisis citométrico de flujo de interferón-gamma intracelular (IFN-γ) como se describió anteriormente (Figura 2).
>2. Inducción de la replicación del VHB a través de la administración hidrodinámica del plásmido del VHB
NOTA: La construcción pAAV/HBV1.2 se generó como se describió anteriormente. El ADN completo del VHB 1.2 se incorpora al vector pAAV.
- Entregas hidrodinámicas de plásmido VHB a través de la vena de cola
- Calentar ratones HHD usando una lámpara de calor durante 5 minutos en la jaula para dilatar la vena de la cola.
- Sujetar al animal por medio de un retenedor y limpiar las colas de los ratones con etanol en spray al 70%.
- Entrega de plásmido en el hígado.
- Mide el peso corporal del ratón utilizando una báscula de medición.
- Diluir 10 μg de plásmido del VHB en el equivalente al 8% de la masa corporal PBS (por ejemplo, 1,6 ml para un ratón de 20 g). Cargue el plásmido diluido en una jeringa de 3 ml con una aguja hipodérmica de 26 g × 1/2" (0,45 × 12 mm).
- Ubique una de las dos venas laterales de la cola en el tercio medio de la cola y coloque la aguja en cualquiera de las venas laterales. Administre la inyección que contiene plásmido del VHB a través de la vena de la cola en un plazo de 3 a 5 s.
- Cuantificación de viremia a partir de suero sanguíneo de ratones infectados
nota: La replicación del VHB se produce desde el día 3 hasta el 35 en el suero del ratón. La replicación del ADN alcanza su punto máximo el día 7 y se reduce gradualmente. El ADN del VHB no se elimina del suero hasta el día 35.
- Recolección de suero sanguíneo de ratones infectados
- Recoja aproximadamente 0,1 mL de sangre en un tubo de microcentrífuga de cada ratón a los 3, 5, 7 y 10 días después de la infección mediante sangrado retroorbitario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y luego incube a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos.
- Centrifugar la muestra a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C y recoger el sobrenadante sérico después de la centrifugación.
- Purifique el ADN del suero sanguíneo utilizando un kit de extracción de ADN disponible en el mercado siguiendo las recomendaciones del fabricante. Brevemente, lisar las células en una columna a base de sílice, realizar los lavados y extraer el ADN agregando etanol al 100% a la columna de elución y centrifugando a 6000 x g durante 1 min. Eluir el ADN en 50 μL de agua libre de RNasa.
- Utilice 100 ng de ADN del VHB de la elución para el análisis de PCR en tiempo real. Utilice los siguientes cebadores y sondas: avance 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; reverso 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Utilice el plásmido que contiene el genoma del VHB (pAAV/HBV1.2) para la curva estándar y realice una PCR en tiempo real en un volumen total de 10 μL (Figura 3).
- Configure la reacción de PCR en un volumen total de 10 μL, como se muestra en la Tabla 1.
- Configure el programa de PCR en el termociclador, como se muestra en la Tabla 2. La tasa de transición de temperatura programada es de 20 °C/s para desnaturalización/recocido y de 5 °C/s para extensión. Mida la fluorescencia al final de la fase de recocido para cada ciclo para el monitoreo de PCR en tiempo real.
>3. Reducción de la replicación del VHB por ACT de linfocitos T iPSC-CD8+ específicos de Ag viral
- Transferencia de células adoptivas (ACT)
- Diferenciar las s183/iPSCs (1.3.7) en las células estromales OP9-DL1-DL4 en presencia de mFlt-3L y mIL-7 durante 8 días, como se describe en la sección 1.3.
- El día 22, recoja las células T iPSC-CD8+ de la placa de 10 cm con tripsina, luego lave y vuelva a suspender cada placa de 10 cm en 10 ml de medios frescos. Agregue las celdas a un plato nuevo de 10 cm y regrese a la incubadora durante 30 minutos, como se hizo en la sección 1.3. Después de 30 minutos, recoja las células flotantes.
- Utilice un colador de nailon de 70 μm para pasar las células y eliminar los grupos de células y contar el número de células. Adapte las células a una concentración de 1,5 x 107 células/ml en una solución fría de PBS y utilice un colador de nailon de 70 μm para pasar las células y eliminar los grupos de células de nuevo si es necesario. Mantenga las células en hielo hasta el ACT.
- Inyecte 200 μL de suspensión celular (3 x 106 células) en ratones HHD de 4 a 6 semanas de edad a través de la vena de la cola.
- Inducción de la replicación del VHB
- El día 14 después de la transferencia celular, realice la administración hidrodinámica del plásmido VHB a través de la vena de cola como se describe en la sección 2.1.
Tabla 1: Volumen de reacción de PCR
| Plantilla de ADN | 2 ml |
| Mezcla de hibridación maestra de ADN (ADN polimerasa Taq, tampón de reacción PCR, 10 mM MgCl2 y mezcla de dNTP) | 1 ml |
| 25 mM MgCl2 | 0,8 ml |
| 0,3 μM la sonda | 3 ml |
| 5 μM de cada cebador | 3,2 ml |
| total | 10 ml |
Tabla 2: Programa de PCR
| desnaturalización | Temperatura
95 °C | Hora
5 s |
| recocido | 53 °C | 10 s |
| extensión | 72 °C | 20 s |
| 5 °C | |
