Una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino

Resumen

Fuente: Haque, M. et al., Desarrollo de células T reguladoras específicas de antígenos derivadas de células madre contra la autoinmunidad.J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra una terapia basada en células para la artritis autoinmune en ratones. Las células T reguladoras derivadas de iPSC que expresan receptores específicos de ovoalbúmina se inyectan con albúmina sérica bovina metilada (mBSA) emulsionada en un adyuvante. Las células presentadoras de antígenos murinos (APC) procesan y presentan la mBSA a las células T, lo que provoca la activación de las células T y la migración a la membrana sinovial de la articulación de la rodilla. Las inyecciones posteriores involucran mBSA solo en la rodilla izquierda y una combinación de mBSA y ovoalbúmina en la rodilla derecha. En la rodilla izquierda, la respuesta inmunitaria a la mBSA desencadena la artritis, mientras que en la rodilla derecha, las células T reguladoras que interactúan con la ovoalbúmina mitigan la inflamación, mejorando los síntomas de la artritis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Maduración in vivo y supresión de la artritis autoinmune

1. Generar los constructos que se utilizarán en la transducción retroviral mediante la subclonación de los genes del receptor de células T (TCR) OT-II y la proteína 3 de la caja de horquilla (FoxP3) en el plásmido MiDR unido con el péptido 2A de autoescisión para crear el constructo MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Realizar la transducción retroviral de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando células Plat E como línea celular de empaquetamiento.
3. Diferenciación in vivo e inducción de artritis en ratones.
   1. Diferencie las iPSC transducidas por OT-II TCR/FoxP3 (OT-II-FoxP3/iPSC), las iPSC transducidas por FoxP3 y las iPSC transducidas por DsRed en las células estromales OP9-DL1-DL4-I-A^b en presencia de citocinas mFlt-3L y mIL-7 durante 8 días.
   2. En el día 0, siembre las células b OP9-DL1-DL4-I-A a una densidad mínima de 10⁴ células/^cm2 utilizando medios OP-9 (medios α-MEM que contengan un 20% de suero fetal de ternero (FCS) y 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. Plato 1 x 10⁶ celdas por plato de 10 cm.
   3. En el día 3, cuando las células b OP9-DL1-DL4-I-A confluentes en un 80-90%, retire el medio y siembre 0,5 - 1 x 10⁵ iPSC sobre las células b OP9-DL1-DL4--I-A en los medios OP-9.
      NOTA: Esto establece el cocultivo de iPSCs en células b OP9-DL1-DL4-I-A y se considera el día 0 de diferenciación.
   4. El día 5, retire el medio de la placa de 10 cm por aspiración, lave las células con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y aspire el PBS. Añadir 4 ml de tripsina al 0,25% e incubar a 37 °C durante 10 min. Añada otros 8 ml de medios iPSC a las células, vuelva a suspenderlas y centrifugue a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      1. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 10 ml de medio iPSC. Incube estas células resuspendidas en un plato fresco de 10 cm y devuélvalas a la incubadora durante 30 min.
         NOTA: Retire las celdas alimentadoras OP9-DL1-DL4-I-A^b y mantenga las iPSC diferenciadoras en el medio. Mantenga las células b OP9-DL1-DL4-I-A de forma continua para lograr una confluencia del 80 al 90% para un mayor cocultivo.
      2. Después de 30 minutos, recoja las células flotantes, fíltrelas a través de un colador de células de 70 μm y cuéntelas con un hemocitómetro.
   5. Siembrar 5 x 10⁵ de iPSCs hasta un 80-90% de células b OP9-DL1-DL4-I-A en medios OP9. Complemente el medio con mFlt-3L a una concentración final de 5 ng/ml.
   6. Tripsinice los tres tipos de células de la placa de 10 cm y vuelva a suspender las células de cada placa de 10 cm en 10 ml de medio fresco. Agregue las celdas a un plato fresco de 10 cm y regrese a la incubadora durante 30 minutos. Después de 30 minutos, recoja las células flotantes.
   7. Pase las células a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar los grupos de células y contarlas con un hemocitómetro. Ajuste las celdas a una concentración de 1,5 x 10⁷ celdas/ml en PBS frío y vuelva a filtrar si es necesario. Mantenga las células en hielo hasta que las células adoptivas se transfieran a los ratones.
   8. Inyecte 200 μl de la suspensión celular (3 x 10⁶ células) en tres grupos diferentes de ratones hembra C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad a través de la vena de la cola.
   9. El día 10, después de la transferencia celular, inyecte a los ratones 100 μg de albúmina sérica bovina metilada (mBSA) emulsionada en el adyuvante completo de Freund en la base de la cola utilizando una jeringa de 1 ml.
   10. El día 17, anestesia a los ratones con un vaporizador de isoflurano. Utilice 4 - 5% de isoflurano para la inducción y 1 - 2% para el mantenimiento. Inducir artritis mediante inyección intraarticular de 20 μg mBSA en 10 μl de PBS en la articulación de la rodilla izquierda y de 20 μg de mBSA y 100 μg de ovoalbúmina entera (OVA) en 10 μl de PBS en la articulación de la rodilla derecha. Se pueden colocar alimentos y una bolsa de gel en el piso de la cama después de que se haya desarrollado la artritis. Los ratones serán sacrificados: Puntuación de condición corporal (BCS) de 2/5 o moribundo, caquexia grave y/o decúbito persistente (un período de 24 horas) y puntuación de gravedad de 4. En la puntuación 4, el eritema y la hinchazón severa abarcan el tobillo, pie, y dedos, o anquilosas de la extremidad.
4. Caracterización de las iPSCs transducidas por OT-II TCR/FoxP3.
   1. Utilice un microscopio fluorescente (20X) para visualizar células vivas DsRed⁺ GFP⁺ no fijadas.
   2. Examinar la integración y expresión génica tanto por Western blot como por citometría de flujo.
5. Ensayo de supresión de la artritis
   1. Mida la hinchazón de ambas rodillas de los ratones antes de la inducción de la artritis mediante el uso de un calibrador de cuadrante para establecer una línea de base.
   2. Siga los pasos (1.3.1 - 1.3.10) para la inducción de la artritis y la transferencia de Treg. Mida las rodillas del ratón con un calibrador de dial después de la transferencia de Treg.
   3. Calcule el aumento porcentual en el diámetro de la rodilla: Porcentaje de aumento = (Diámetro de la rodilla en el día 1 - Diámetro de la rodilla en el día 0) / Diámetro de la rodilla en el día 0.
6. Medición de la destrucción articular y de la infiltración de células inflamatorias en las rodillas mediante histología (Figura 1).
   1. En el día 7 después de la inducción de la artritis, se sacrificó a los ratones mediante inhalación de dióxido de carbono (CO₂) seguida de dislocación cervical. Retire el vello de las rodillas con una maquinilla eléctrica y extirpe las rodillas mediante un procedimiento quirúrgico.
   2. Retire la piel de las piernas haciendo una incisión en la pata trasera con unas tijeras de punta roma y corte la piel a través del muslo hasta el tobillo. Pela suavemente la piel sobre la pierna y el pie para exponer el músculo. Retire el músculo de la pierna con cuidado sin dañar la articulación de la rodilla.
      1. Corta la pata trasera justo por encima de la articulación pélvica/cadera y corta la tibia con unas tijeras diseccionadoras afiladas.
   3. Fije las rodillas en formalina al 4% durante 48 h. Descalcifique las rodillas con ácido fórmico 2,5 M; enjuague tres veces en xileno durante 3 minutos, enjuague dos veces en etanol al 100%, enjuague dos veces en etanol al 95%, enjuague dos veces en agua desionizada durante 2 minutos y descalcifique en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. Tratar a temperatura inferior a ebullición (90 °C) durante 20 min.
   4. Retire ambas rodillas, fije en formalina al 10% y calcifique en Formical-4. Incrustar los tejidos en parafina, cortar a 4 μm, y teñir con hematoxilina y eosina (H & E) o safranina O tinción y observar bajo un microscopio.

Resultados

Figura 1: La transferencia adoptiva de iPSC-Tregs específicos de Ag mejora el AIA en ratones. Las iPSC murinas se transducieron con la construcción retroviral MiDR, MiDR-FoxP3 o MiDR-TCR-FoxP3 y se cocultivaron en^{las células b} OP9-DL1/DL4/I-A. El día 7, las células transducidas por genes (3 × 10⁶/ratón) se transfirieron adoptivamente a ratones hembra C57BL/6 ind...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones C57BL/6j	Laboratorio Jackson	664
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Polibreno	sigma	107689
Genejammer	Ciencia integrada	204130
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	Artículo 217-17
mBSA	sigma	A7906
Ovo-albúmina	Vanguardia	0440-01
Cfa	Difco	2017014
Sujetador de venas de cola	Braintree científico	RTV 150-STD
Paraformaldehido	sigma	P6148-500G	Precaución: Alergénico, cancerígeno, Nocivo