Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Esplenectomía y preparación de células T
Día 0:
- Vierta 10 ml de medio de células T (MTC) en un cónico de 50 ml y colóquelo en hielo para la recolección del bazo.
- Sacrificar el número apropiado de animales por asfixia por CO2 y decapitación secundaria: Coloque a los animales en una jaula que reciba CO2 a una tasa de flujo de 10-30% de volumen de jaula por minuto, según las pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (no se pueden sacrificar más de 5 animales simultáneamente) hasta que termine la respiración y durante dos minutos después. Retire a los animales de la cámara de CO2 y decapitalos.
nota: Un bazo de un ratón hembra C57BL/6 de 6 a 12 semanas de edad producirá aproximadamente 4,5-5 x 107 esplenocitos. Aquí, se recolectarán 4 bazos para aproximadamente 200 x 106 celdas.
- Coloque el ratón de manera que su lado derecho quede hacia arriba y rocíe con etanol al 70%. Con las pinzas, agarre un pliegue delgado de piel debajo de la caja torácica izquierda y haga una pequeña incisión con las tijeras. Retire la piel, agarre con cuidado un pliegue delgado del peritoneo con pinzas y corte una pequeña cavidad.
- El bazo es un órgano pequeño, alargado y de color rojo oscuro que se asemeja a un frijol aplanado; agarre delicadamente el bazo con las pinzas y extirpe cortando el tejido conectivo circundante. Coloque los bazos extirpados en el cónico que contiene 10 ml de MTC en hielo.
- Vierta el bazo sobre un filtro de células de malla de 70 μm y disgregúrelo machacando con el extremo romo del interior de una jeringa de 5 ml para generar una suspensión de una sola célula. Se debe disgregar un máximo de dos bazos por colador de malla.
- Use un pequeño volumen de MTC para lavar cuidadosamente el colador después de la desagregación para recolectar los esplenocitos restantes. Agrupe todos los bazos disgregados en una suspensión de una sola célula. Llevar el volumen final a 50 ml con TCM para un lavado y centrifugar a 300 x g durante 10 min.
- Prepare una solución de tampón de lisis 1x añadiendo 5 ml de tampón de lisis 10x a 45 ml de agua estéril. Para eliminar los glóbulos rojos, vuelva a suspender el pellet en 5 ml de 1x tampón de lisis por bazo en un recipiente cónico de 50 ml, mezclando bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Si supera los 5 bazos, utilice un tubo de centrífuga de 250 ml. Coloque el tubo cónico o centrífugo en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
- Retire la reacción de lisis del baño de agua y agregue TCM en una proporción de 1:1 con tampón de lisis para neutralizar la reacción. Lavar centrifugando a 300 x g durante 10 min.
- Aspire el sobrenadante y resuspenda completamente el pellet en TCM (2 ml/bazo, 8 ml en total para 4 bazos) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Cuente las células añadiendo 10 μl de suspensión celular a 190 μl de azul de tripán (dilución 1:20). Multiplique el número obtenido en uno de los cuatro cuadrados cuadriculados por 20 x 104 x volumen total (8 ml) para obtener el número total de células (por ejemplo, 125 células x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 esplenocitos).
- Diluir las células hasta una concentración de 2 x 106 células/ml en MTC, suplementadas con 2 μg/ml de concanavalina A (ConA) y 50 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2). Por lo tanto, para 200 x 106 esplenocitos, agregue 92 ml de medio a 8 ml de células, 200 μg de ConA y 5,000 UI de rhIL-2.
- Agregue 2 mL de células a cada pocillo de placas tratadas con cultivo de tejido de 24 pocillos, de modo que haya 4 x 106 celdas en cada pocillo (por ejemplo, 100 ml de celdas requerirán aproximadamente 4 placas).
- Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
>2. Transducción
Día 1:
- Calcule el número de placas de 24 pocillos tratadas sin cultivo de tejidos necesarias para la transducción multiplicando el número de bazos extraídos por 2 (se necesitan 8 placas para 4 bazos).
- A continuación, calcule el volumen requerido de solución de fragmento de fibronectina humana recombinante (RHFF) necesaria para recubrir las placas multiplicando (número total de pocillos + 3) x 0,5 ml (8 placas x 24 pocillos = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
- Prepare 97,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga RHFF a una concentración de 25 μg/ml multiplicando el volumen total por 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Agregue esta cantidad de RHFF a 97,5 ml de PBS.
- Cubra las placas de 24 pocillos tratadas con cultivo no tisular añadiendo 0,5 ml de solución de PBS/RHFF por pocillo.
- Incubar durante la noche a 4 °C.
Día 2:
- Volque la solución de PBS/RHFF de placas de 24 pocillos tratadas sin cultivo de tejidos.
- Añadir 1 ml/pocillo de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en PBS e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Retire BSA colocando firmemente la placa. Lavar añadiendo 2 ml de PBS.
- Recoja el sobrenadante viral transfiriendo los medios de cada placa recubierta de 293T (HEK293T)-poli-D-lisina (PDL) de riñón embrionario humano a un tubo de centrífuga de 250 ml y centrifuga durante 10 minutos a 500 x g.
- Transfiera con cuidado el sobrenadante viral a un tubo de centrífuga nuevo de 250 ml, asegurándose de no alterar la pelletza celular que se haya formado.
- Agregue TCM fresco al sobrenadante viral de modo que el volumen final sea 3 ml más que la cantidad necesaria para los pocillos recubiertos de RHFF. Por ejemplo, para 192 pocillos recubiertos de RHFF, aumente el volumen de sobrenadante viral a 192 + 3 ml = 195 ml.
- Retire los esplenocitos cultivados de la incubadora y vuelva a suspenderlos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 o 3 veces en cada pocillo. Transfiera a un cónico de 250 ml. Si se utiliza una pipeta multicanal, el uso de un depósito estéril antes de la transferencia ayudará a acelerar este paso. Cuente como se describió anteriormente y gire a 300 x g durante 10 minutos.
- Añadir interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2) al sobrenadante viral a una concentración de 50 UI/ml. Por ejemplo, agregue 50 x 195 = 9,750 UI de rhIL-2 a 195 ml de sobrenadante viral.
- Resuspender los esplenocitos en el sobrenadante viral a 1 x 106 células/ml
- Añada 1 ml/pocillo de suspensión de esplenocitos a las placas de 24 pocillos recubiertas de RHFF.
- Centrifugar durante 90 minutos según los siguientes ajustes: 770 x g, aceleración = 4, freno/deceleración = 0, 32 °C.
- Prepare una solución de MTC con 50 UI/ml de rhIL-2. Por ejemplo, prepare una solución de 200 TCM agregando 10,000 UI de rhIL-2. Añadir 1 ml de rhIL-2/TCM a cada pocillo después de la centrifugación.
- Cultivo durante la noche a 37 °C en 5% CO2.
>3. Cultivo y cosecha de células CAR-T
Días 3 y 4:
- Si las células T alcanzan una confluencia del >80%, las células pueden dividirse (esto suele ocurrir en el día 3 o en el día 4). Para dividir las células, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo 2-3 veces, y mover 1 ml de cada pocillo a nuevos pocillos de una placa fresca de 24 pocillos tratada con cultivo de tejido. A continuación, añada 1 ml de MTC fresca con 50 UI/ml de IL-2 a cada pocillo, de modo que el volumen final sea de 2 ml en todos los pocillos.
- Si las células no alcanzan >80% de confluencia, realice un cambio de medio medio pipeteando lentamente 1 ml de medio desde la parte superior de cada pocillo. Evite perturbar las celdas asentadas en la parte inferior mientras retira los medios. Añadir 1 ml de MTC fresca que contenga 50 UI/ml de rhIL-2.
Día 5:
- Vuelva a suspender las células CAR-T pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 veces en cada pocillo y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 250 ml. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 10 min.
- Aspirar completamente el sobrenadante sin pellet perturbador. Lave una vez con PBS, cuente las células como se describió anteriormente y lávese con PBS por segunda vez. El rendimiento típico de un linfocito T con CAR es de aproximadamente 1 x 106 células por pocillo (8 placas x 24 pocillos = 192 x 106 células T con CAR).
- Resuspender las células en PBS a una concentración de 5 x 107/ml para una inyección de 1 x 107 en un volumen de 200 μg (por ejemplo, para 192 x 106 células CAR-T, resuspender el pellet lavado en 3,84 ml de PBS).
