Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto. Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Expansión inespecífica de linfocitos T efectores citotóxicos
- Prepare e irradie las células alimentadoras a 35 Gy. Para la estimulación de 2 x 105 - 4 x 105 células efectoras, prepare 10 x 106 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y 1 x 106 líneas de células linfoblastoides B (BLCL) de tres donantes sanos distintos.
- Resuspenda tanto las células alimentadoras como las células efectoras en 15 mL de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL) y 300 UI/mL de interleucina-2 recombinante (IL-2).
- Agregue fitohemaglutinina (PHA-L) a una concentración final de 1 μg/mL, mezcle cuidadosamente y distribuya 150 μL de la suspensión celular por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos.
- Incubar a 37 °C y con 5% deCO2 en atmósfera humidificada.
- Revise diariamente la placa hasta que se formen grandes grupos de células en los pocillos de cultivo (~día 7).
- Transfiera las células a un matraz de cultivo a 1 x 106 células/mL en medio de cultivo fresco.
- Determine el número total de células mediante conteo (2 veces por semana) y manténgalas en 1 x 106 células/mL en medio de cultivo fresco.
nota: Las células inmunitarias efectoras deben estar listas para la administración terapéutica en un estado de reposo (generalmente 3 semanas después del estímulo de amplificación inicial). La pureza y la reactividad de estas células efectoras deben comprobarse antes de las inyecciones in vivo (por ejemplo, con ensayos in vitro).
>2. Preparación preoperatoria de células efectoras
- Después de verificar el recuento de células efectoras, recoja las células efectoras en un tubo de 50 ml por centrifugación (300 x g durante 5 min).
nota: Para compensar cualquier pérdida, prepare un exceso de celdas (por ejemplo, 50 x 106).
- Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 15 mL de PBS estéril y centrifugue durante 5 min a 300 x g para realizar el lavado.
- Retire con cuidado y por completo el sobrenadante y luego vuelva a suspender el pellet de células en 1 ml de PBS estéril.
- Transfiera las células resuspendidas en un microtubo de 1,5 ml para su centrifugación a 300 x g durante 5 min.
- Retire con cuidado y por completo el sobrenadante pipeteando lentamente.
- Resuspender el pellet celular en 8 μL de PBS estéril por ratón.
nota: Este es un paso crítico.
- Mida el volumen de la suspensión celular utilizando una micropipeta. Si es necesario, agregue PBS estéril (20 x 106 células en 15 μL de PBS por dosis) y mezcle cuidadosamente.
- Comprobar, mediante el uso de una micropipeta, que el volumen final por ratón esté entre 15 y 20 μL (imperativamente < 20 μL).
- Mantenga las células en hielo hasta la inyección estereotáctica.
nota: No se probaron más de 3 puntos de tiempo.
>3. Inyección estereotáctica
- Puesta a punto del equipo
- Ensamble y calibre un marco estereotáctico para animales pequeños de acuerdo con las instrucciones del fabricante para garantizar la precisión de las inyecciones intracraneales (p. ej., tamaño de la jeringa, volumen deseado y velocidad de inyección)
nota: Se recomienda una velocidad de infusión lenta (es decir, 2 - 3 μL/min).
- Instale el material debajo de una cabina de seguridad microbiana (MSC) para mantener la esterilidad de los instrumentos y proteger a los ratones de infecciones><.
nota: Colocar los "bloques isotérmicos" en un baño de agua a 37 °C. Este sistema limita la hipotermia de los ratones durante la cirugía. Las almohadillas térmicas, que son necesarias para el cuidado posterior al procedimiento, deben usarse durante el monitoreo continuo de la temperatura.
- Preparación preoperatoria de los animales
- Anestesiar a un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (10 mg/mL) y xilacina (0,1 mg/mL) a 10 μL/g de peso corporal del ratón.
- Realizar una prueba de pinzamiento de los dedos del pie para asegurar la anestesia y analgesia completa del animal.
nota: Cualquier movimiento es un indicio de analgesia no profunda y, si eso ocurre, se requieren unos minutos más antes de repetir la operación.
- Una vez que el ratón esté debidamente anestesiado, use unas tijeras para quitar el pelo del sitio quirúrgico (entre las dos orejas, hasta la nariz).
- Preparación preoperatoria de las células
- Vuelva a suspender cuidadosamente las células con una pipeta (varias veces) antes de cada inyección para evitar la aglomeración de células.
- Extraiga con cuidado el volumen de suspensión celular requerido (15 - 20 μL) en la microjeringa de 22 g para evitar la aspiración de burbujas><.
nota: Este paso de carga celular en la microjeringa es importante para minimizar las variaciones en los volúmenes inyectados. Vuelva a cargar las células para cada inyección individual entre procedimientos para evitar la aglomeración de células y garantizar la administración de un número par de células efectoras en la cohorte.
- A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada.
- Cuidado procesal
- Desinfecte el sitio quirúrgico con hisopos empapados en una solución de povidona yodada al 5% al menos 3 veces.
- Coloque un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón para evitar que se sequen las córneas.
- Coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico, sobre un bloque isotérmico caliente cubierto con una envoltura de plástico estéril para mantener la temperatura del ratón durante la cirugía y limitar la mortalidad.
nota: La nariz y los dientes del ratón deben estar colocados adecuadamente por encima de la barra dentada, para asegurar un flujo respiratorio adecuado durante el procedimiento.
- Una vez que el ratón esté colocado sobre la barra de dientes, apriete las barras de las orejas firmemente debajo de las orejas del ratón para inmovilizar la cabeza.
nota: Tenga cuidado de no dañar los tímpanos o comprometer la respiración.
- Hacer una incisión de 1 a 2 cm en la línea media de la piel sagital con tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo de anterior a posterior para exponer el cráneo.
- Identificar la intersección de las suturas sagital y coronal (Bregma) para que sirvan como puntos de referencia para la localización estereotáctica antes de la inyección (como se muestra en la Figura 1).
- Coloque la microjeringa por encima de este punto.
- Mueva la microjeringa 2 mm lateral derecho y 0,5 mm anterior al Bregma.
- Con un microtaladro, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca estéril en coordenadas predeterminadas. Tenga cuidado de permanecer superficial para evitar cualquier lesión traumática del cerebro.
nota: En este protocolo, se inyectaron células inmunitarias dentro de un tumor establecido (una semana después de la inyección de células tumorales). La piel debe volver a abrirse (cicatriz) y la inyección se realiza en las mismas coordenadas utilizadas para la implantación de las células tumorales (el orificio generalmente sigue presente hasta 2 semanas después de la inyección). Se seleccionaron las coordenadas para inyectar células tumorales y efectoras en el parénquima cerebral.
- Inyección de células inmunitarias efectoras
- Inserte con cuidado la microjeringa en el orificio perforado y, moviéndose lentamente, avance la aguja 3 mm hacia abajo en la duramadre y luego retroceda 0,5 mm hasta una profundidad final de 2,5 mm antes de inyectar las células efectoras.
- Ejecute la inyección de células efectoras a 2 - 3 μL/min y controle a los ratones durante todo el tiempo de inyección.
- Una vez finalizada la inyección, retire la aguja solo 1 mm y mantenga la microjeringa en su lugar durante un minuto más antes de retirar lentamente la microjeringa por completo, para evitar cualquier fuga del lugar de infusión.
nota: Después de retirar al animal del dispositivo estereotáctico, limpie inmediatamente el equipo de inyección para los próximos experimentos.
- Cuidados postoperatorios y seguimiento del ratón
- Retire al animal del marco estereotáxico e inmediatamente aplique una solución de povidona yodada al 5% en el sitio de la incisión y cierre la piel con una sutura quirúrgica adecuada.
- Aplicar gel de lidocaína al 2% directamente sobre la herida y administrar 0,15 μg/g de buprenorfina mediante inyección subcutánea para la analgesia post-procedimiento.
- Vuelva a colocar el ratón anestesiado en su jaula sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para mantener una temperatura corporal adecuada del ratón y evitar cualquier hipotermia.
nota: No es necesaria una carcasa separada.
- Monitoree el ratón hasta que esté completamente recuperado de la anestesia y transfiéralo a una habitación de alojamiento.
nota: Hasta la fecha, este protocolo está bien respaldado, ya que se han producido pocas complicaciones imprevistas (< el 5% de los ratones inyectados).
- Monitoree diariamente a los ratones y eutanasiélos cuando se observe algún signo de salud en declive (p. ej., postura encorvada, movilidad reducida, postración o pérdida significativa de peso corporal [≥ 15%]).
