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Artículo de método
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8 de julio de 2025
Fuente: Sterner, R. M. et al., Uso de CRISPR/Cas9 para eliminar GM-CSF en células CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)
El video describe un proceso para crear células CAR-T modificadas genéticamente a través del sistema CRISPR-Cas9. La infección de las células T con lentivirus CRISPR y CAR da lugar a modificaciones en el gen diana y a la síntesis de un receptor de antígeno quimérico o CAR, lo que en última instancia conduce a la formación de células CAR-T modificadas genéticamente.
1. Producción de células CART19
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticuerpo monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | Teléfono 17-0038-42 | |
| Elección Taq Blue Mastermix | Científico de Denville | C775Y51 | |
| CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Sistema CytoFLEX B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | Citómetro de flujo |
| Dimetilsulfóxido | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Concentrador de partículas magnéticas) | Biosistemas Aplicados | A13346 | |
| Imán Easy 50 EasySep | Tecnologías STEMCELL | Año 18002 | |
| Kit de aislamiento de células T humanas EasySep | Tecnologías STEMCELL | Año 17951 | Perlas magnéticas de selección negativa; 17951RF incluye puntas y tampón |
| Suero fetal bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Medio de fijación (medio A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| Construcción de ARNg GenCRISPR: Nombre: CSF2 | GenScript | N/A | Orden personalizada |
| ARN guía 1 de CRISPR; Especie: Humano, Vector: | |||
| pLentiCRISPR v2; Resistencia: Ampicilina; Número de copia: | |||
| Alto; Preparación de plásmidos: Entrega estándar: 4 μg (Gratis | |||
| de cargo) | |||
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Genética de escritorio | ||
| Suero AB Humano; donantes masculinos; tipo AB; Nos | Corning | 35-060-CI | |
| El anticuerpo monoclonal IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000075 | |
| Kit de tinción de celdas muertas Aqua Deadcell fijable LIVE/DEAD, para excitación de 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Linfopp | Tecnologías STEMCELL | 7851 | |
| Solución de Monensina, 1000X | BioLeyenda | 420701 | |
| Ratón Anti-Humano CD28 Clon CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Ratón Anti-Humano CD49d Clon 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Ratón antihumano MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Contenedor de congelación Mr. Frosty | Termo Científico | 5100-0001 | |
| NALM6, clon G5 | ATCC | CRL-3273 | Línea celular de leucemia linfoblástica aguda |
| Agua libre de nucleasas | Promega | P119C | |
| Sistemas de Filtro al Vacío Olympus, 500 mL, Membrana PES, 0.22uM, estéril | Genesee Científico | 25-227 | |
| Sistemas de Filtro al Vacío Olympus, 500 mL, Membrana PES, 0.45uM, estéril | Genesee Científico | 25-228 | |
| Opti-MEM I Sérum Reducido Medio (1X), Líquido | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Ratón Anti-Humano IL-2 | BD Horizonte | 562384 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido | Gibco | 10378-016 | |
| Medio de permeabilización (medio B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| Mini kit de ADN genómico PureLink | Invitrogen | K182001 | |
| Dihidrocloruro de puromicina | MP Biomedicals, Inc. | 210055210 | |
| Kit de extracción de gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Rata Anti-Humana GM-CSF BV421 | BD Horizonte | 562930 | |
| RoboSep-S | Tecnologías STEMCELL | Año 21000 | Separador de células totalmente automatizado |
| SepMate-50 (IVD) | Tecnologías STEMCELL | 85450 | |
| Azida de sodio, 5% (p/v) | Ricca Química | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero | Lonza | 04-418Q |
