Modificación genética de células CAR-T mediante un sistema CRISPR-Cas9

Resumen

Fuente: Sterner, R. M. et al., Uso de CRISPR/Cas9 para eliminar GM-CSF en células CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

El video describe un proceso para crear células CAR-T modificadas genéticamente a través del sistema CRISPR-Cas9. La infección de las células T con lentivirus CRISPR y CAR da lugar a modificaciones en el gen diana y a la síntesis de un receptor de antígeno quimérico o CAR, lo que en última instancia conduce a la formación de células CAR-T modificadas genéticamente.

Protocolo

1. Producción de células CART19

1. Aislamiento, estimulación y cultivo ex vivo de células T
   1. Llevar a cabo todos los trabajos de cultivo celular en una campana de cultivo celular utilizando el equipo de protección personal adecuado. Recolectar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de sangre de donantes normales no identificados recolectados durante la aféresis, ya que se sabe que son una fuente viable de PBMC.
   2. Para aislar las PBMC, agregue 15 mL de un medio de gradiente de densidad a un tubo de separación de gradiente de densidad de 50 mL. Diluir la sangre del donante con un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS) para evitar el atrapamiento celular.
      1. Agregue la sangre del donante diluida del cono al tubo de separación, con cuidado de no alterar la interfaz entre la sangre y el medio de gradiente de densidad. Centrífuga a 1.200 x g durante 10 min en RT.
      2. Decantar el sobrenadante en un nuevo cónico de 50 mL, lavar con PBS + 2% FBS llevando hasta 40 mL, centrifugar a 300 x g durante 8 min a RT, aspirar el sobrenadante, resuspender en 40 mL de tampón y contar las células.
   3. Aísle las células T de las PBMC a través de un kit de perlas magnéticas de selección negativa utilizando un separador de células totalmente automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   4. Para cultivar las células T aisladas, prepare un medio de células T (MTC) que consista en un 10% de suero AB humano (v/v), un 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) y medio de células hematopoyéticas sin suero. Esterilice el medio filtrando a través de un filtro de vacío estéril de 0,45 μm y luego con un filtro de vacío estéril de 0,22 μm.
   5. El día 0 (el día de la estimulación de las células T), lave las perlas de CD3/CD28 antes de la estimulación de las células T. Para lavar, coloque el volumen requerido de perlas (use suficientes perlas CD3/CD28 para una proporción de perlas 3:1:células T; tenga en cuenta que la concentración de perlas puede ser variable) en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL y resuspender en 1 mL de TCM.
   6. Colocar en contacto con un imán.
   7. Después de 1 min, aspire el TCM y vuelva a suspender en 1 mL de TCM fresco para lavar las perlas.
   8. Repita este procedimiento durante un total de tres lavados.
   9. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las perlas en 1 mL de TCM.
   10. Cuenta las células T.
   11. Transfiera las perlas a las células T en una proporción de 3:1 perlas:células.
   12. Diluya las células hasta una concentración final de 1 x 10⁶ células/mL.
   13. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.
2. Transfección y transducción de células T
   1. Lleve a cabo el trabajo lentiviral utilizando las precauciones BSL-2+, incluidas las campanas de cultivo celular, el equipo de protección personal y la desinfección de los materiales usados con lejía antes de desecharlos.
   2. Adquisición de un constructo de receptor de antígeno quimérico-T19 (CART19) en un vector lentiviral.
      nota: La construcción CART19 utilizada aquí se diseñó y luego se sintetizó de novo utilizando un proveedor de síntesis de proteínas disponible comercialmente. Posteriormente, la construcción CAR se clonó en un lentivirus de tercera generación bajo el control de un promotor EF-1α. El fragmento de región variable de cadena única se deriva del clon FMC63 y reconoce el CD19 humano. El constructo CAR19 posee un dominio coestimulador 4-1BB de segunda generación y estimulación CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Realizar la producción lentiviral como se ha descrito anteriormente.
      1. En resumen, para producir lentivirus, utilice células 293T que hayan alcanzado un 70-90% de confluencia.
      2. Permitir la incubación durante 30 min a temperatura ambiente de los reactivos de transfección, incluidos 15 μg del plásmido lentiviral de interés, 18 μg de un vector de empaquetamiento gag/pol/tat/rev, 7 μg de un vector de envoltura VSV-G, 111 μL del reactivo de precomplejación, 129 μL del reactivo de transfección y 9,0 mL del medio de transfección antes de añadirlos a las células 293T. A continuación, cultive las células transfectadas a 37 °C, 5% de CO₂.
      3. Cosecha, centrifugar (900 x g durante 10 min), filtrar (filtro de nylon de 0,45 μM) y concentrar el sobrenadante a las 24 y 48 h por ultracentrifugación a 13.028 x g durante 18 h o 112.700 x g durante 2 h.
      4. Congelar a -80 °C para uso futuro.
   4. El día 1, vuelva a suspender suavemente las células T para romper las rosetas de células T que habían sido estimuladas a 1 x 10⁶/mL en el día 0.
   5. Bajo las precauciones apropiadas de BSL-2+ para todo el trabajo lentiviral, agregue virus frescos o congelados cosechados a las células T estimuladas con una multiplicidad de infección (MOI) de 3.0.
3. Expansión de las células T con CAR
   1. Durante la fase de expansión, continúe incubando las células T transducidas a 37 °C, 5% de CO₂. Cuente las células T con CAR en los días 3 y 5, y agregue MTC fresca y precalentada al cultivo para mantener una concentración de células T con CAR de 1 x 10⁶/mL.
   2. Retire las perlas de las células T transducidas 6 días después de la estimulación (día 6) con un imán. Recoja, resuspenda y coloque las células T en tubos cónicos de 50 ml en un imán durante 1 minuto. A continuación, recoja el sobrenadante (contiene las células T con CAR) y deseche las perlas.
   3. Vuelva a colocar las células T con CAR recolectadas en cultivo a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml para reanudar la expansión.
   4. El día 6, evalúe la expresión superficial del CAR por citometría de flujo.
      nota: Se pueden utilizar varios métodos para detectar la expresión superficial de CAR, como la tinción con un anticuerpo secundario adsorbido por vía cruzada IgG (H+L) anti-ratón en cabra o mediante la tinción con un péptido específico CD19, conjugado con un fluorocromo. En este caso, se toma una alícuota (unas 100.000 células T) del cultivo y se lava con tampón de flujo preparado con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, suero fetal bovino al 2% y azida sódica al 1%. Tiñe las células con el anticuerpo anti-CAR y lávalas dos veces. Teñir las células con tinción viva/muerta y anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3). Lave las células y vuelva a suspender en el tampón de flujo. Adquirir en un citómetro para determinar la eficiencia de la transducción.
4. Criopreservación de células T con CAR
   1. Para recolectar y criopreservar células T con CAR 8 días después de la estimulación (día 8 de expansión de las células T), recoja las células del cultivo.
   2. Girar durante 5 min a 300 x g.
   3. Resuspender en medio de congelación a 10 millones de células por mL por vial en medio de congelación compuesto por 10% de dimetilsulfóxido y 90% de suero fetal bovino.
   4. Congele en un recipiente de congelación para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 °C/min en un congelador de -80 °C y luego transfiéralo a nitrógeno líquido después de 48 h.
   5. Antes de su uso para experimentos in vitro o in vivo, descongele las células T con CAR en MTC tibia.
   6. Lave las células para diluir y eliminar el dimetilsulfóxido y vuelva a suspender a una concentración de 2 x 10⁶ células/mL en TCM caliente. Descansar toda la noche a 37 °C, 5% CO₂.

>2. Producción de CART19 del factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF ^k/o)

1. Para interrumpir el GM-CSF, utilice un ARN guía (ARNg) dirigido al exón 3 del GM-CSF humano (CSF2) seleccionado a través de ARNg de cribado que se ha informado previamente que tiene una alta eficiencia para el gen CSF2 que codifica para la citocina humana GM-CSF.
   nota: Se utilizó una construcción lentiviral de tercera generación Cas9 de grado de investigación sintetizada comercialmente que contenía este ARNg (bajo un promotor U6). El constructo contiene un gen de resistencia a la puromicina. La secuencia del ARNg es GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Para producir lentivirus, utilice células 293T que hayan alcanzado un 70-90% de confluencia.
3. Deje incubar 15 μg del plásmido lentiviral de interés, 18 μg de un vector de empaquetamiento gag/pol/tat/rev, 7 μg de un vector de envoltura VSV-G, 111 μL del reactivo de pre-complejación, 129 μL del reactivo de transfección y 9,0 mL del medio de transfección durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Añada reactivos de transfección a las células 293T. El cultivo a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO₂).
5. Cosecha, centrifugar (900 x g durante 10 min), filtrar (filtro de nylon de 0,45 μM) y concentrar el sobrenadante a las 24 y 48 h por ultracentrifugación a 13.028 x g durante 18 h o 112.700 x g durante 2 h y congelar a -80 °C para uso futuro.
6. El día 1, vuelva a suspender suavemente las células T para romper las rosetas.
7. En un laboratorio aprobado por BSL-2+, agregue un virus congelado o recién cosechado a las células T estimuladas para generar células T con CAR. Transducir células T con el lentivirus CAR19 y el lentivirus GM-CSF dirigido a CRISPR. Agregue el lentivirus CAR19 a un MOI de 3. Dado que la valoración del lentivirus CRISPR no era factible, se utilizaron partículas de virus generadas a partir de una preparación de plásmido de 15 ug para transducir células T de 10 x 10⁶.
8. Consulte los pasos restantes de la estimulación, expansión y criopreservación de células T, como se explica en el paso 1.
9. En el caso de los linfocitos T editados con lentiCRISPR que portan resistencia a la puromicina, trate las células con diclorhidrato de puromicina a una concentración de 1 μg de puromicina por 1 ml el día 3 y el día 5.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
Anticuerpo monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	Teléfono 17-0038-42
Elección Taq Blue Mastermix	Científico de Denville	C775Y51
CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
Sistema CytoFLEX B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	Citómetro de flujo
Dimetilsulfóxido	Millipore Sigma	D2650-100ML
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Concentrador de partículas magnéticas)	Biosistemas Aplicados	A13346
Imán Easy 50 EasySep	Tecnologías STEMCELL	Año 18002
Kit de aislamiento de células T humanas EasySep	Tecnologías STEMCELL	Año 17951	Perlas magnéticas de selección negativa; 17951RF incluye puntas y tampón
Suero fetal bovino	Millipore Sigma	F8067
FITC Ratón Anti-Humano CD107a	BD Pharmingen	555800
Medio de fijación (medio A)	Invitrogen	GAS001S100
Construcción de ARNg GenCRISPR: Nombre: CSF2	GenScript	N/A	Orden personalizada
ARN guía 1 de CRISPR; Especie: Humano, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistencia: Ampicilina; Número de copia:
Alto; Preparación de plásmidos: Entrega estándar: 4 μg (Gratis
de cargo)
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Genética de escritorio
Suero AB Humano; donantes masculinos; tipo AB; Nos	Corning	35-060-CI
El anticuerpo monoclonal IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Reactivo de transfección Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000075
Kit de tinción de celdas muertas Aqua Deadcell fijable LIVE/DEAD, para excitación de 405 nm	Invitrogen	L34966
Linfopp	Tecnologías STEMCELL	7851
Solución de Monensina, 1000X	BioLeyenda	420701
Ratón Anti-Humano CD28 Clon CD28.2	BD Pharmingen	559770
Ratón Anti-Humano CD49d Clon 9F10	BD Pharmingen	561892
Ratón antihumano MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Contenedor de congelación Mr. Frosty	Termo Científico	5100-0001
NALM6, clon G5	ATCC	CRL-3273	Línea celular de leucemia linfoblástica aguda
Agua libre de nucleasas	Promega	P119C
Sistemas de Filtro al Vacío Olympus, 500 mL, Membrana PES, 0.22uM, estéril	Genesee Científico	25-227
Sistemas de Filtro al Vacío Olympus, 500 mL, Membrana PES, 0.45uM, estéril	Genesee Científico	25-228
Opti-MEM I Sérum Reducido Medio (1X), Líquido	Gibco	31985-070
PE-CF594 Ratón Anti-Humano IL-2	BD Horizonte	562384
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido	Gibco	10378-016
Medio de permeabilización (medio B)	Invitrogen	GAS002S100
Mini kit de ADN genómico PureLink	Invitrogen	K182001
Dihidrocloruro de puromicina	MP Biomedicals, Inc.	210055210
Kit de extracción de gel QIAquick	QIAGEN	28704
Rata Anti-Humana GM-CSF BV421	BD Horizonte	562930
RoboSep-S	Tecnologías STEMCELL	Año 21000	Separador de células totalmente automatizado
SepMate-50 (IVD)	Tecnologías STEMCELL	85450
Azida de sodio, 5% (p/v)	Ricca Química	7144.8-16
X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero	Lonza	04-418Q