Una técnica CRISPR-Cas9 para la edición de genes en células T

En este artículo

Resumen

Fuente: Agarwal, S., et al. Producción de células CAR-T humanas modificadas con CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un ensayo para realizar la edición de genes en células T humanas utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Una mezcla de linfocitos T primarios CD4+ y CD8+ se combina con un complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9, dirigiéndose a genes específicos para su eliminación. Tras la electroporación, el sgRNA guía a Cas9 a la secuencia de ADN objetivo, creando cortes precisos. Estos cortes son reparados por el mecanismo de unión de extremos no homólogos de la célula, lo que lleva a la eliminación del gen.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Diseño de sgRNAs y disrupción génica en células T humanas primarias

Diseño de sgRNAs de CRISPR
nota: Varios servidores y programas facilitan el diseño de ARN de guía única (sgRNA) específicos de la diana. En este protocolo, se diseñaron sgRNAs agrupados de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas (CRISPR) utilizando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) y el portal de diseño de gRNA del Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
1. Para cada gen diana, diseñe de seis a diez secuencias de sgRNA para dirigirse a secuencias de exones codificantes tempranos.
  NOTA: el sgRNA debe tener una alta eficacia en el objetivo y una baja eficacia fuera del objetivo. Cada algoritmo de aprendizaje automático para determinar la eficacia del sgRNA funciona de forma ligeramente diferente. Por lo tanto, se recomienda comparar varias herramientas de diseño de sgRNA y seleccionar una lista de seis a diez sgRNA para la detección.
Disrupción génica en células T humanas primarias
1. Obtener células mononucleares autólogas de sangre periférica (PBMC) de donantes voluntarios sanos. En la Figura 1A se describe una línea de tiempo esquemática del protocolo, que se describe a continuación.
2. Aísle las células T CD4+ y CD8+ utilizando kits de selección de CD4 y CD8 disponibles en el mercado.
3. Combine las células T CD4+ y CD8+ en una proporción de 1:1 e incube durante la noche a 3x10⁶ células/mL en R10 suplementadas con 5 ng/mL de interleucina-7 humana (huIL-7) e interleucina-15 humana (huIL-15) cada una. Se recomienda la adición de IL-7 e IL-15, ya que se sabe que promueven un fenotipo de memoria central y las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) expandidas con IL-7 e IL-15 tienen una eficacia antitumoral superior en comparación con las células CAR-T expandidas con interleucina-2 (IL-2).
4. Al día siguiente, cuente las células T y centrifugue 5-10 x 10⁶ células a 300 x g durante 5 min. Deseche todo el sobrenadante y lave el pellet de células en medios esenciales mínimos de suero reducido. Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de solución de nucleofección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
5. Mientras lava las células, prepare el complejo de ribonucleoproteína (RNP) con la proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR y el ARNg incubando 10 μg de nucleasa Cas9 con 5 μg de ARNs durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). La relación molar de Cas9 a sgRNA es de 1:2.4. Se recomienda un control simulado que contenga Cas9 y un potenciador de electroporación, pero no sgRNA.
  nota: La edición génica multiplex se puede realizar en este paso creando complejos RNP para cada objetivo por separado y combinándolos con células en el momento de la nucleofección, como se describe en el siguiente paso. La elección de los reactivos para ensamblar el complejo RNP es clave para obtener una alta eficiencia de knockout (KO). Por ejemplo, las nucleasas Cas9 de diferentes proveedores tienen diferentes efectos fuera del objetivo, y el ARNg modificado químicamente disminuye la toxicidad para las células T, lo que aumenta la eficiencia de KO.
6. Combine las células resuspendidas del paso 1.2.4 con el complejo RNP del paso 1.2.5 y agregue 4.2 μL de potenciador de electroporación de 4 μM (oligonucleótido de ADN monocatenario [ssDNA] que no es homólogo al genoma humano). Mezcle bien y transfiera a cubetas de electroporación. Evite las burbujas, ya que perjudican la eficiencia de la electroporación.
7. Celdas electroporadas con código de pulso EH111. Después de la electroporación, incubar las células en R10 suplementadas con 5 ng/mL de huIL-7 y huIL-15 a 5x10⁶ células/mL a 30 °C durante 48 h en placas de 12 pocillos. Después de 48 h, proceda con la activación y expansión de las células T.

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Resultados

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Figura 1. Expansión de las células CAR-T editadas y la duplicación de su población. (A) Cronología de la edición y fabricación de CRISPR en células CART humanas primarias. (B) Duplicaciones de población en células CAR-T CD19 simuladas y editadas con CRISPR medidas utilizando un contador de Coulter durante la expansión de las células CAR-T (n = 3 dona...