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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Alojamiento y mantenimiento de ratones
- Compre ratones NSG de 6 a 8 semanas de edad (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Aloje a los ratones en condiciones de SPF con intercambio de aire, prefiltros y filtros de aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) (0,22 μm) en una habitación con temperatura, humedad y presión controladas.
- Aloje y mantenga a los ratones en jaulas de microaisladores individuales esterilizadas en autoclave en un sistema de rack capaz de gestionar el intercambio de aire con prefiltros y filtros HEPA (0,22 μm).
- Realizar todos los procedimientos y manipulaciones de los ratones en una campana de gases de seguridad biológica Clase II Tipo A2 que ha sido pretratada con etanol al 70%. Antes de trabajar en la habitación de los animales, dúchese y cámbiese a batas limpias, traje Tyvek, cubrebotas, gorro para el cabello, mascarilla y guantes. Use una bata de cirugía sobre el traje Tyvek durante los procedimientos quirúrgicos.
nota: También se prefiere la descontaminación con luz ultravioleta (UV) antes de los procedimientos.
- Esterilizar en autoclave todos los instrumentos y reactivos si es posible, y luego desinfectarlos antes de transferirlos a la campana extractora.
- Durante los procedimientos, retire las jaulas de los animales con ventilación individual del estante y desinféctelas antes de transferirlas a la campana extractora.
- Alimente a los ratones con una dieta irradiada y proporcióneles agua esterilizada en autoclave. Proporcione alimentos irradiados y complemente con alimentos irradiados adicionales según sea necesario. Cambie el agua esterilizada en autoclave semanalmente o según sea necesario.
nota: También se puede utilizar agua acidificada esterilizada en autoclave. La dieta irradiada suministrada tuvo una vida útil de 6 meses después de la fabricación.
>2. Generación de ratones humanizados de médula ósea, hígado y timo (BLT)
NOTA: La generación de ratones hu-BLT ha sido descrita anteriormente.
- El día de la cirugía, administre a los ratones irradiación de cuerpo entero a una dosis de 12 cGy/g de peso corporal.
- Prepara a los ratones para la cirugía.
- Administre a cada ratón irradiado una mezcla de ketamina a la concentración de trabajo de 100 mg/kg y xilacina a la concentración de 12 mg/kg, que osciló entre 130 y 170 μL por ratón en función del peso corporal, mediante inyección intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml de la mezcla de ketamina y xilacina, agregue 0,27 mL de Ketamina a la concentración de 100 mg/mL y 0,03 mL de Xilacina a la concentración de 100 mg/mL a 2,7 mL de solución salina estéril y mezcle bien. Desinfecte la piel con isopropanol al 70% antes de la inyección.
- Administre a cada ratón irradiado buprenorfina 1 mg/kg de peso corporal (semivivo 72 h, SR-LAB) mediante inyección subcutánea para el tratamiento duradero del dolor.
- Administre a cada ratón irradiado 100 μL (858 μg) de cefazolina por inyección IP para la profilaxis antibiótica preoperatoria.
- Afeitar el pelo de los ratones con cortapelos eléctricos alrededor del lado lateral izquierdo y medial del ratón en el sitio quirúrgico posterior utilizado para exponer el riñón izquierdo.
- Verifique el nivel adecuado de anestesia mediante un reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie).
- Administre gas isoflurano al 3-5% si se necesita anestesia adicional en cualquier momento durante la cirugía.
- Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la desecación de la córnea. Colóquele un crotal si es necesario.
- Realizar una cirugía para implantar los tejidos del hígado y el timo en la cápsula del riñón izquierdo.
- Desinfectar la piel en el sitio quirúrgico aplicando un exfoliante de yodo comenzando desde el centro del sitio quirúrgico y moviéndose hacia el exterior de manera circular. Repita este proceso con isopropanol al 70% y una tercera vez con yodo.
- Con fórceps, primero cargue un fragmento de tejido hepático fetal humano en un trócar. Luego, con fórceps, cargue un fragmento de tejido de timo fetal humano en el trócar. Luego, con fórceps, cargue otro fragmento de tejido hepático fetal humano en el trócar. Los pañuelos deben cortarse a 1-1,6 mm3 para adaptarse a las dimensiones internas del trocar.
- Use pinzas para levantar la piel y use tijeras para hacer un pequeño corte longitudinal. Extienda el corte a 1,5-2 cm en el lado izquierdo del ratón.
- Use pinzas para levantar la capa muscular y use tijeras para hacer un pequeño corte longitudinal. Extienda la incisión según sea necesario para exponer el riñón.
- Exponga el riñón agarrando suavemente el tejido graso que lo rodea. No toque directamente el parénquima renal.
- Haga una incisión de 1-2 mm en el extremo posterior de la cápsula renal con un bisturí.
- Inserte lentamente el trócar precargado a través de la incisión paralela al eje largo del riñón y libere los tejidos entre la cápsula renal y el riñón.
- Vuelva a colocar con cuidado el riñón y el intestino en su posición normal. Utilice suturas absorbibles 5/0 P-3 (P-13) con aguja circular de 13 mm 3/8 para cerrar la capa muscular y grapas quirúrgicas para cerrar la piel.
- Después de la cirugía, coloque al ratón en una jaula de microaislador limpia en autoclave para su recuperación.
- Para minimizar la pérdida de calor durante la recuperación posquirúrgica, coloque la jaula que contiene a los ratones en una almohadilla térmica que esté conectada a una bomba de agua que calienta y hace circular el agua.
- Monitoree a los ratones hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.
- Dentro de las 6 horas posteriores a la finalización de la cirugía, inyecte a través de la vena de la cola, células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas de tejido hepático fetal humano.
- Calienta los ratones con una lámpara de calor. Desinfecte la cola con isopropanol al 70% y luego inyecte de 1,5 a 5 × 105 células madre/200 μL en la vena de la cola.
- Detenga cualquier sangrado de la inyección y devuelva los ratones a la jaula del microaislador y la jaula del microaislador al estante de la jaula.
nota: Los ratones postoperatorios suelen alojarse juntos, cinco por jaula de microaislamiento, durante y después de la recuperación. Sin embargo, los ratones solo se alojan juntos si todos recibieron la cirugía el mismo día.
- Revisa a los ratones a diario. Monitoree cuidadosamente las grapas quirúrgicas y reemplácelas según sea necesario. Vigile de cerca a los ratones para detectar cualquier signo de infección o malestar. Suministre alimentos esterilizados en autoclave en el suelo de la jaula del microaislador durante unos días después de la cirugía.
- Retire las grapas quirúrgicas de 7 a 10 días después de la cirugía. Dar gas isoflurano al 3-5% para anestesiar a los ratones. Retire con cuidado las grapas y luego aplique un antibiótico y un ungüento analgésico en el sitio.
- Espere de 9 a 12 semanas para la reconstitución de las células inmunitarias humanas, luego recoja sangre periférica de la vena safena medial de cada uno de los ratones humanizados.
- Sujete a los ratones conscientes usando un cono de sujeción de plástico de tamaño adecuado con una abertura cerca de la cabeza del ratón para respirar y una abertura cerca de la parte posterior del ratón para aislar una pata. Coloque a los ratones en el cono de sujeción con la cabeza primero y luego tire suavemente de una pata a través de la abertura de la pata.
- Rocíe el lado medial de la pierna aislada con isopropanol al 70%, luego extienda el antibiótico y el ungüento analgésico en el mismo sitio.
nota: El ungüento ayuda a revelar la ubicación de la vena sin necesidad de depilación y también ayuda en la formación de gotas de sangre.
- Con una aguja de calibre 25 en un ángulo de 90°, perfore la vena y recoja de 50 a 100 μL de sangre con un tubo de extracción de sangre recubierto de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Detenga el sangrado aplicando presión en el sitio con una gasa estéril. Una vez que el sangrado se haya detenido, devuelva los ratones a su jaula.
nota: Los volúmenes máximos de sangre recolectados suelen ser de 50 μL por semana o 100 μL cada dos semanas.
- Utilice la sangre periférica recolectada para analizar el nivel de reconstitución de las células inmunitarias humanas mediante citometría de flujo con anticuerpos contra hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
>3. Tratamiento con antibióticos
- Antes del tratamiento con antibióticos, recoja muestras fecales previas al tratamiento. Mueva los ratones a una nueva jaula de microaislamiento esterilizada en autoclave.
- Prepare un cóctel fresco de antibióticos de amplio espectro todos los días.
- Prepare 250 mL de agua que contenga metronidazol (1 g/L), neomicina (1 g/L), vancomicina (0,5 g/L) y ampicilina (1 g/L) recién preparados para cada jaula microaislante de ratones.
nota: Use agua esterilizada o esterilizada en autoclave para el agua potable suplementada con antibióticos.
- Añadir 9,2 g de mezcla de bebida azucarada con azúcar de uva a 250 ml de agua con suplementos antibióticos.
nota: El uso de una mezcla de bebida endulzada con azúcar de uva enmascara el sabor amargo de los antibióticos y ayuda a prevenir la deshidratación en los ratones.
- Cambie el antibiótico y la bebida endulzada con azúcar de uva, mezcle el agua suplementada y coloque a los ratones en una nueva jaula esterilizada en autoclave todos los días.
nota: Los ratones son coprófagos y cambiar las jaulas a diario evita que los ratones se vuelvan a inocular con bacterias intestinales.
- Para obtener el máximo injerto del microbioma intestinal similar al humano, proporcione antibióticos durante 14 días. Durante el tratamiento con antibióticos, controle la pérdida de peso y la deshidratación de los ratones. Se espera una pérdida de peso durante los primeros 3-4 días y se estabiliza después de eso durante la duración del tratamiento. Si se produce deshidratación, administre a los ratones solución salina o Ringers mediante inyección intraperitoneal.
nota: Otros protocolos de humanización del microbioma intestinal requieren la sonda oral de antibióticos. Si bien es eficaz para agotar las bacterias intestinales murinas, descubrimos que el método menos invasivo de agregar antibióticos al agua potable ejerció menos estrés en nuestros ratones humanizados y condujo a mejores resultados.
>4. Muestras de donantes y trasplante fecal
- Preparar muestras fecales de donantes humanos.
- Utilice fuentes de material de trasplante de microbiota fecal (TMF) debidamente preparado para el trasplante fecal en ratones humanizados.
- Descongelar las preparaciones de TMF y alícuotas en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica.
- Si lo desea, en este paso mezcle partes iguales de las muestras fecales para crear una muestra "humana" imparcial.
- Mantenga la congelación y descongelación del material FMT al mínimo, si no es necesario aliquotar o mezclar muestras, solo descongele inmediatamente antes del procedimiento.
- Trasplante fecal humano
- Después de completar 14 días de tratamiento con antibióticos, cambie el agua potable por agua esterilizada en autoclave y traslade a los ratones a una nueva jaula esterilizada en autoclave. Detenga los cambios diarios de jaulas e implemente un horario de cambios de jaula una vez cada 1-2 semanas.
- Realizar dos trasplantes fecales a las 24 y 48 horas después del cese de los antibióticos.
- 24 h después del tratamiento con antibióticos, descongele la cantidad necesaria de material FMT y administre a cada ratón 200 μL de material FMT por sonda oral. Repita el procedimiento nuevamente a las 48 h después de los antibióticos.
- Extienda cualquier material FMT descongelado restante o sobrante en el pelaje de los ratones humanizados o en la cama de la jaula.