Generación de una vacuna multivalente contra vesículas de membrana externa

Abstract

Fuente: Feng, R., et al. Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra un método para generar vacunas de vesículas de membrana externa (OMV) de visualización multivalente. Las células de mamíferos se transfectan para expresar y secretar antígenos virales fusionados a un SpyTag y un tag de polihistidina. A continuación, estos antígenos se purifican utilizando una columna de afinidad de ácido níquel-nitritriacético (Ni-NTA). El antígeno purificado se mezcla con vesículas de membrana externa que expresan la proteína SpyCatcher (SC) unida a la superficie. Múltiples antígenos se adhieren covalentemente a los SpyCatchers a través de sus SpyTags (ST), creando OMV que muestran el antígeno, sirviendo como una vacuna multivalente.

Protocol

1. Construcción de plásmidos

1. Inserte la secuencia SpyCatcher que codifica el ADN (Figura 1) en un plásmido de pThioHisA-Cytolysina A (ClyA) resistente a la ampicilina (ver Tabla de Materiales) entre los sitios BamH I y Sal I para construir el plásmido pThioHisA ClyA-SC siguiendo un informe publicado anteriormente.
2. Limetrie el gen de fusión sintetizado SpyTag-SARS-CoV-2 receptor de dominio de unión (RBD)-etiqueta de polihistidina (Histag) (Figura 1) en un plásmido pcDNA3.1 (ver Tabla de materiales) entre los sitios BamH I y EcoR I para construir el plásmido pcDNA3.1 RBD-ST siguiendo un informe publicado anteriormente.

>2. Preparación OMV-SC

1. Realice la transformación ClyA-SC siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Añadir 5 μL de solución de plásmido pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, soplar suavemente y dejar enfriar en hielo durante 30 min.
   2. Coloque la solución durante 90 s en el baño de agua a 42 °C y, a continuación, ponga inmediatamente la solución mezclada en hielo durante 3 minutos.
   3. Añadir 500 μL de medio Luria-Bertani (LB) a la suspensión bacteriana y, después de mezclar, cultivar a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
   4. Colocar toda la transformación en una placa de agar LB que contenga ampicilina (100 μg/mL, ver Tabla de Materiales) y cultivar durante la noche a 37 °C.
      nota: En experimentos posteriores, la ampicilina se mantuvo a la misma concentración en el medio. De lo contrario, esto puede causar la pérdida de plásmidos en las bacterias.
2. Para la producción de OMV-SC, realice los pasos que se indican a continuación.
   1. Aísle una sola colonia de la placa (paso 2.1.4.) a 20 mL de medio LB (resistente a la ampicilina) y cultive durante la noche a 220 rpm a 37 °C.
   2. Inocular la solución bacteriana (del paso 2.2.1.) en un medio de 2 L, cultivar a 220 rpm, 37 °C durante 5 h hasta la etapa de crecimiento logarítmico (el diámetro exterior de₆₀₀nm está entre 0,6 y 0,8).
   3. Cuando la OD a 600 nm de la solución bacteriana alcance 0,6-0,8, agregue isopropil beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG, ver Tabla de Materiales) para que la concentración final de la solución bacteriana sea de 0,5 mM, y luego cultive durante la noche a 220 rpm a 25 °C.
3. Realizar la purificación de OMV-SC.
   1. Centrifugar la solución bacteriana a 7.000 x g a 4 °C durante 30 min.
   2. Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 μm, luego concéntrelo usando una membrana de ultrafiltración de 100 kD o una columna de fibra hueca (ver Tabla de Materiales).
   3. Filtrar el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 μm, luego centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h usando una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales), y desechar el sobrenadante con una pipeta.
   4. Vuelva a suspender la precipitación con PBS y guárdela a -80 °C. La solución puede mantener la estabilidad a largo plazo a -80 °C.

>3. Preparación RBD-ST

1. Realice la transfección RBD-ST siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Seleccione un sistema de expresión eucariota apropiado (por ejemplo, HEK293F) y cultive las células durante la noche a 130 rpm a 37 °C después de la recuperación.
   2. Añada 20 μL de solución de células HEK293F en el contador de células automatizado (consulte la Tabla de materiales), registre el número de células, ajuste la concentración a 1 x 106 células/ml y, a continuación, cultive las células a 130 rpm a 37 °C durante 4 h.
   3. Filtrar el plásmido RBD-ST a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y añadir 300 μg de plásmidos en el medio de cultivo celular (ver Tabla de Materiales) hasta que el volumen final sea de 10 mL; agitar durante 10 s.
   4. Calentar polietilenimina (PEI, 1 mg/mL, ver Tabla de Materiales) a 65 °C en el baño de agua, mezclar 0,7 mL de PEI con 9,3 mL de medio de cultivo celular y agitar intermitentemente durante 10 s.
      nota: No agite la solución con fuerza. De lo contrario, las burbujas resultantes pueden afectar la eficiencia de la transfección.
   5. Añadir la solución de plásmido a la solución de PEI, agitar la mezcla de forma intermitente durante 10 s e incubar a 37 °C durante 15 min.
   6. Añadir la mezcla a 280 mL de medio de cultivo celular y cultivar a 130 rpm a 37 °C durante 5 días.
2. Realizar la purificación RBD-ST.
   1. Centrifugar las células a 6.000 x g a 25 °C durante 20 min y utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante.
   2. Llene la columna con 2 mL de agarosa Ni-NTA (ver Tabla de Materiales) y lávela 3 veces con PBS 3x.
   3. Agregue imidazol (ver Tabla de Materiales) en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 mM, y cargue el sobrenadante celular 2x.
   4. Añadir 3 volúmenes de columna (CV) de PBS que contengan 20 mM de imidazol para el lavado, y recoger la fracción de lavado.
   5. Eluido en gradiente con 3 CV de PBS que contiene concentraciones bajas a altas (por ejemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; eluido 2x para cada concentración.
   6. Utilice SDS-PAGE para identificar el RBD-ST en diferentes gradientes de concentración.

>4. Bioconjugación y purificación OMV-RBD

1. Determine la concentración de proteínas mediante el método de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (ver Tabla de Materiales).
   1. Diluir en serie la solución estándar de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) de 2 mg/mL a 0,0625 mg/mL, diluir OMV-SC y RBD-ST 10x purificados y, a continuación, mezclar las soluciones de trabajo de BCA A y B (incluidas en el kit de ensayo) en una proporción de 50:1 (v/v).
   2. Añadir solución de proteína diluida (25 μL/pocillo) y mezclar con la solución de trabajo de BCA (200 μL/pocillo); incubar a 37 °C durante 30 min.
   3. Mida la absorbancia (OD) a 562 nm de cada pocillo y calcule la concentración de proteínas a partir de la curva estándar.
2. Realice la bioconjugación de OMV-SC y RBD-ST siguiendo los pasos a continuación.
   1. Mezcle OMV-SC y RBD-ST en PBS en una proporción de 40:1 (p/p).
   2. Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rpm a 4 °C.
      nota: Diferentes antígenos pueden reaccionar en diferentes proporciones. Se podrían probar diferentes proporciones de reacción en función de las características del antígeno.

Results

Figura 1: Secuencias de plásmidos utilizadas en el presente estudio.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicilina sódica	Sangon Biotech	A610028
Contador de células automatizado	Estrella de conteo	biotecnología
Kit de cuantificación de proteínas BCA	cwbio	CW0014S
Aparato de electroforesis	Caboya	Potencia BV
Centrífuga de congelación de alta velocidad	Bioridge	H2500R
Ratón His-Tag mAb	Tecnología de señalización celular	2366 S
imidazol	Sangon Biotech	A600277
Isopropil beta-D-tiogalactopiranósido	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	70691
Medio de cultivo celular OPM-293	Opm biociencias	81075-001
plásmido pcDNA3.1 RBD-ST	Tecnología biológica de Wuhan
Tampón de fosfato salino	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polietilenimina lineal	Policiencias	23966-1
Escalera de proteínas preteñida	termo	26616
plásmido pThioHisA ClyA-SC	Tecnología biológica de Wuhan
Sistemas de sobremesa Quixstand (columna de fibra hueca de 100 kD)	GE Cuidado de la salud
Búfer de carga SDS-PAGE (5x)	Beyotime	P0015
cloruro de sodio	Sangon Biotech	A100241
Instrumento de suspensión	Tecnología de la vida	Mezclador de Hula
Triptona	Oxoide	LP0042B
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	XPN-100
Espectrofotómetro ultravioleta	Hitachi	U-3900
Extracto de levadura	Sangon Biotech	A610961