Un modelo de interposición aórtica de ratón para estudiar el rechazo vascular inducido por el sistema inmunitario

Abstract

Fuente: Enns, W., et al. Modelo de ratón de rechazo vascular inducido por el sistema alomunitario y arteriosclerosis de trasplante. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra un método para generar un modelo de interposición aórtica de ratón para estudiar el rechazo vascular inducido por aloimno. Después de colocar un ratón donante anestesiado en posición supina, la aorta abdominal infrarrenal (AAI) se aísla cuidadosamente de las estructuras circundantes. Los vasos ramificados se ligan y ambos extremos del AAI se sujetan para evitar el flujo sanguíneo antes de la resección. Posteriormente, el AAI donante se implanta en un ratón receptor alogénico y se restablece el flujo sanguíneo mediante anastomosis para investigar el rechazo vascular inducido por el sistema inmunitario.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

Utilice ratones donantes de Balb/cYJ (H2^d) y ratones receptores C57Bl/6 (H2^b) para examinar las reacciones alogénicas. Los ratones se utilizan para experimentos entre las edades de 8 a 12 semanas. Usa ratones hembra o macho. Los controles singénicos consisten en segmentos aórticos de donantes C57Bl/6 a receptores C57Bl/6.

1. Preparación del donante y del receptor

NOTA: Tanto el donante como el receptor son anestesiados y preparados antes de la cirugía para minimizar la isquemia del injerto. Los anestésicos inyectables se utilizan en el protocolo para prevenir la obstrucción del animal por el equipo necesario para la administración de anestésicos inhalados. Sin embargo, si se desea, un anestésico inhalado es una alternativa adecuada. Desde la inyección inicial de los anestésicos, todo el procedimiento tarda aproximadamente 90 minutos en completarse. El tiempo isquémico del injerto es inferior a 30 min.

1. Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg/kg; 10 mg/ml) y xilacina (10 mg/kg; 1 mg/ml). El ratón será sedado en un plazo de 10 a 15 minutos. Evalúe la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata del animal. Administrar 1/3 de la dosis original del cóctel anestésico, según sea necesario, hasta que el animal no muestre un reflejo de abstinencia. Controle de cerca la frecuencia respiratoria después de cada cóctel. Durante la cirugía, evalúe el nivel de anestesia cada 15 minutos pellizcando la pared abdominal anterior con un par de pinzas. Los ratones deben permanecer profundamente anestesiados durante 60 a 90 min.
2. Lubrique los ojos del ratón con un ungüento oftálmico para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
3. Afeita el vello lo más cerca posible de la piel en la región ventral abdominal, desde la mitad del tórax hasta el pubis. Tenga especial cuidado de no rasgar la piel. No use crema depilatoria porque puede ser absorbida por la piel y podría ser inflamatoria.
4. Coloque al animal en decúbito supino sobre una toalla encima de la mesa o almohadilla térmica.
5. Limpie el sitio quirúrgico con un exfoliante preliminar con clorohexidina al 2%. Prepare un área de trabajo grande para maximizar el campo quirúrgico. Comience a frotar en el centro del sitio quirúrgico y muévase hacia el exterior de forma lineal o circular. Deseche la gasa. Repita este procedimiento al menos 5 veces más. Aplique una almohadilla de preparación con alcohol en la misma área. Una vez que el alcohol esté seco, prepare el área limpia con una solución de Betadine y cúbrala con una gasa estéril.

>2. Procedimiento de anastomosis de extremo a extremo

1. Operación del donante
   1. Mantener una técnica aséptica durante toda la operación. Limpie todas las superficies de la encimera y la mesa quirúrgica con una solución de peróxido de hidrógeno acelerado al 0,5 % antes de usar. Envuelva y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, gasas, cortinas y batas antes de usarlos. Verifique la esterilidad de los instrumentos con una tira indicadora de esterilizador de vapor colocada en cada paquete. Los guantes quirúrgicos estériles se usan y se desechan entre cirugías. Para cirugías múltiples, esterilice los instrumentos quirúrgicos entre usos con el esterilizador de perlas de vidrio caliente.
   2. Coloque el ratón donante en decúbito supino sobre una placa de plexiglás delgada y limpia envuelta con un paño estéril debajo del microscopio quirúrgico con un aumento de 8-30X.
   3. Después de asegurar una anestesia quirúrgica adecuada como se describe en la sección 1.1, proceda con la cirugía.
   4. Con unas tijeras estériles, haga una sola incisión en la línea media del abdomen inferior inferior, desde el pubis hasta la apófisis xifoidea.
   5. Abra las paredes abdominales para exponer la cavidad con un pequeño retractor.
   6. Con aplicadores estériles con punta de algodón, retraiga suavemente los intestinos superiormente a la izquierda del animal y cúbralos con una gasa humedecida con solución salina. Mover los órganos reproductores inferiormente y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (VCI). Humedecer periódicamente los tejidos expuestos con solución salina.
   7. Con las pinzas médicas n.º 5, separe la aorta de la VCI, desde el nivel de la arteria renal izquierda hasta la bifurcación. Utilice suturas de monofilamento de poliamida 10-0 para ligar las pequeñas ramas cerca de la aorta.
   8. Una vez que la aorta del donante se haya separado de la VCI, sature el vaso con solución salina, cubra la cavidad expuesta con una gasa humedecida y deje al donante a un lado en un área estéril. Revisar el estado del donante (función respiratoria y cardiovascular y profundidad de la anestesia) cada 15 min. Comience a operar en el receptor, aislando la aorta como se describe a continuación (Pasos 2.2.1 a 2.2.7).
   9. Una vez que la aorta receptora se haya separado de la VCI y se haya reservado, devuelva al donante bajo el microscopio. Pinzamiento cruzado (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta donante, con una separación aproximada de 5 mm, con dos pinzas microvasculares de 4 mm.
   10. Con las microtijeras de Vannas-Tubinga, seccione un pequeño segmento de injerto (de 3 a 4 mm de largo) de la aorta abdominal.
   11. Con una aguja de 25 G 5/8 conectada a una jeringa, enjuague la aorta extirpada con solución salina heparinizada (100 U/ml). Asegúrese de que la punta de la aguja no entre en contacto con el vaso.
   12. Coloque la aorta en solución salina heparinizada (100 U/ml) sobre hielo y reserve. Mientras aún está bajo anestesia profunda, suelte las pinzas microvasculares. Eutanasia del donante por exanguinación.
   13. Implante el vaso donante dentro de los 30 minutos posteriores a la escisión. Aunque es posible utilizar un vaso donante para varios receptores mediante la extirpación de una longitud mayor de la aorta, el tiempo de isquemia debe reducirse a menos de 30 minutos.
2. Operación del destinatario
   1. Mantener una técnica aséptica durante toda la operación, como en la operación de donante.
   2. Coloque el ratón receptor en decúbito supino sobre una delgada placa de plexiglás envuelta con un paño estéril debajo del microscopio quirúrgico con un aumento de 8-30X.
   3. Después de asegurar una anestesia adecuada, se procederá a la cirugía cuando el animal no presente reflejo de retirada.
   4. Con unas tijeras estériles, haga una sola incisión en la línea media del abdomen inferior inferior, desde el pubis hasta la apófisis xifoidea.
   5. Abra las paredes abdominales para exponer la cavidad con un pequeño retractor.
   6. Con aplicadores estériles con punta de algodón, retraiga suavemente los intestinos superiormente a la izquierda del animal y cúbralos con una gasa humedecida con solución salina. Mover los órganos reproductores inferiormente y localizar la aorta infrarrenal y la VCI. Humedecer periódicamente los tejidos expuestos con solución salina.
   7. Separar la aorta de la VCI, desde el nivel de la arteria renal izquierda hasta la bifurcación. Utilice suturas de monofilamento de poliamida 10-0 para ligar las pequeñas ramas cerca de la aorta si es necesario.
   8. Pinzamiento cruzado (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta, con una separación aproximada de 5 mm, con dos pinzas microvasculares de 4 mm.
   9. Con las microtijeras de Vannas-Tubinga, realice una única aortotomía horizontal y reseque un pequeño segmento (no más de 0,5 mm) de la aorta abdominal para acomodar el injerto aórtico del donante.
   10. Enjuague la aorta extirpada con solución salina heparinizada (100 U/ml). El injerto aórtico del donante debe tener la longitud adecuada para conectar los extremos aórticos seccionados del receptor.
   11. Colocar el injerto aórtico del donante en la posición ortotópica y anastomosar el extremo del injerto del donante con el extremo del receptor, haciendo coincidir la orientación anatómica del injerto respectivo con la del receptor.
   12. Agarre suavemente la túnica externa del vaso y ejecútala ligeramente con las pinzas médicas n.º 5. Con las pinzas, introduzca la aguja unida a la sutura de monofilamento de poliamida 10-0 a través de todo el espesor de la pared del vaso para asegurar el injerto aórtico del donante al vaso resecado del receptor. Asegúrese de que la abertura de la embarcación no esté cerrada debido a costuras inadvertidas de la pared posterior de la embarcación.
   13. Para puntos continuos, coloque las suturas atirantadas a las 9 en punto en los extremos superior e inferior del injerto. Comenzando en el extremo superior del injerto a partir de las 3 en punto, anastomosa los extremos resecados con 2 suturas continuas y asegure la sutura a la sutura del soporte.
       1. Dar la vuelta al injerto y continuar la sutura corrida hasta la parte dorsal del vaso, encontrándose con la sutura del soporte de origen. Asegúrelo sin aplicar mucha presión sobre el recipiente. Repetir la sutura para la anastomosis inferior.
          Nota: Las suturas interrumpidas comienzan de la misma manera que las suturas continuas, excepto que el vaso se anastomosa con tres puntos separados entre las suturas de estancia. El tiempo de anastomosis suele ser de 20 min.
   14. Una vez completada la anastomosis, suelte la pinza microvascular distal para permitir el flujo de sangre retrógrada y comprobar si hay fugas en los sitios anastomosados. Si hay una fuga, coloque inmediatamente una puntada para cerrar el sitio defectuoso. Si no hay sangrado en los sitios, suelte la pinza proximal.
   15. Examinar el trasplante y comprobar que no haya obstrucción sanguínea en el injerto y en las porciones proximal y distal del vaso del receptor. Un patrón de pulso vigoroso en los vasos del donante y del receptor indica que la sangre fluye libremente. Con el par de pinzas, agarre suavemente un extremo de las suturas del soporte y everta ligeramente el vaso para inspeccionar la pared posterior del vaso.
       nota: No debe haber arrugas en la pared del vaso en ambos extremos de los sitios anastomosos. El flujo sanguíneo deficiente después de la extracción de las pinzas es un signo de trombosis.
   16. Regrese los intestinos a la cavidad abdominal con aplicadores con punta de algodón.
   17. Con el portaagujas Castroviejo y las pinzas Graefe, cierre la pared abdominal con suturas de polipropileno 5-0 mediante suturas continuas. Cierre la capa de piel con las mismas suturas mediante cierre subcuticular.
   18. Administrar Torbugesic (1 mg/kg) i.m. inmediatamente después de finalizar el trasplante.
   19. Administre inmediatamente, en el orden, Atipamezol (1 mg/kg), ketoprofeno (5 mg/kg) y la solución de Ringer lactada calentada por vía subcutánea.
   20. Inmediatamente después de la cirugía, coloque a los ratones en una jaula caliente debajo de una manta de agua durante la noche (12 horas). Durante el período de recuperación anestésica, coloque a los animales solos en un área limpia, seca y sin obstrucciones. Cubra la jaula (esterilizada en autoclave) con toallas de papel limpias y ajuste la temperatura de la manta de agua a aproximadamente 20 a 22 °C. Proporcione croquetas secas y húmedas ad libitum en el suelo de la jaula.
       nota: Un componente esencial de la atención postquirúrgica es la observación del animal y la intervención adecuada, según sea necesario, durante la recuperación de la anestesia y la cirugía. La intensidad de la monitorización necesaria variará con el animal y puede ser mayor durante el período de recuperación anestésica inmediata que más tarde en la recuperación postoperatoria.
   21. Monitorear continuamente a los animales que han sido anestesiados hasta que se recuperen por completo. El animal debe ser capaz de mantener un decúbito esternal sin ayuda, y debe parecer tranquilo y libre de dolor antes de dejarlo desatendido.
   22. Administre buprenorfina (0,1 mg/kg dos veces al día) y ketoprofeno (5 mg/kg SID) durante tres días, ambos por vía subcutánea.
   23. Controle la función cardiovascular y respiratoria, la temperatura corporal y el dolor o malestar postoperatorio durante la recuperación de la anestesia durante al menos tres días. Es posible que se requieran cuidados adicionales, como la administración de analgésicos y otros medicamentos y líquidos parenterales para minimizar la deshidratación y la pérdida de electrolitos.
   24. Evaluar el éxito de la cirugía de trasplante mediante la observación de la función motora de las extremidades traseras. El éxito completo del trasplante implica un flujo sanguíneo sin obstrucciones a la extremidad trasera y la cola, que debe ser inmediato tras la recuperación del animal, y una recuperación completa sin parálisis de las extremidades traseras al segundo día.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2B)	Laboratorios Jackson, Bar Harbour ME	Cepa# 000664
Balb/cBYJ	Laboratorios Jackson, Bar Harbour ME	Cepa# 001026
Inyección de clorhidrato de ketamina USP 100 mg / mL	Ketalean	DIN 00612316
Xilacina inyectable 20 mg/mL	Rompum	DIN 02169592
Ketoprofeno inyectable 100 mg/mL	Anafen	DIN 01938126
Inyección de tartrato de butorfanol 10 mg/mL	Torbugesic	DIN 008450000
Buprenorfina inyectable 0,3 mg/mL	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
Clorhidrato de atipamezol solución inyectable estéril	Antisedán	DIN 02237744
Inyección de heparina sódica, USP, 1000 unidades/mL	Distribución de McKesson	DIN 02264315
Pomada oftálmica Tears naturale	Alcon	DIN 02082519
Microscopio estereoscópico	Leica	M80
Cloruro de sodio al 0,9%, estéril	Corporación Baxter
Solución de Ringer lactato, estéril	Corporación Baxter
Cloruro de sodio al 0,9% inyectable, estéril, 10 mL	Corporación Baxter
Almohadillas de preparación con alcohol	Loris
Povidona yodada	Betadine
Gluconato de clorohexidina 4% p/v	Germi-Estadísticas
Monofilamento de poliamida negra	Instrumentos AROSúrgicos	T4A10Q07
Sutura, sutura 10-0, 70 micras	corporación
Sutura monofilamento azul 5-0, aguja P3	Ethicon	8698G
Jeringa de 1 ml	Bd	REF 309659
Jeringa de 10 ml	Bd	REF 309604
Jeringa de insulina TB de 1 cc con 28G 1/2	Bd	REF 309309
25G 7/8, aguja hipodérmica	Bd	REF 305124
27G 1/2, aguja hipodérmica	Bd	REF 305109
Retractor Colibrí- 1,5 cm, extensión 4 cm	Herramientas de Bellas Ciencias	17000-04
S&T CAF-4 Pinza de aplicación de pinzas, sin bloqueo	Herramientas de Bellas Ciencias	00072-14
Pinzas Supergrip, S&T	Herramientas de Bellas Ciencias	00632-11
Pinzas médicas n.º 5	Herramientas de Bellas Ciencias	11253-20
Tijeras para bebés Lexer	Herramientas de Bellas Ciencias	14078-10
Pinza dentada Micro Adson	Herramientas de Bellas Ciencias	11018-12
Microtijeras Vannas-Tubingen	Herramientas de Bellas Ciencias	15003-08
Micro abrazaderas, b-1; 3,5 mm x 1 mm; 7 mm de longitud	Herramientas de Bellas Ciencias	00396-01
Pinza de Graefe, 10cm 1x2 dientes	Herramientas de Bellas Ciencias	11054-10
Castroviejo con cerradura y mordazas de tungsteno	Herramientas de Bellas Ciencias	12565-14
Esterilizador de perlas de vidrio caliente	Inotech 250	IS-250 - Steri-250
Gasas no tejidas	Progene
Aplicadores con punta de algodón	puritano
Recortadora de barba	Wahl
Almohadilla térmica	rayo de sol