Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación quirúrgica, anestesia y régimen de analgesia
- Coloque un paño desechable estéril (45,7 cm x 66 cm) sobre la plataforma quirúrgica. Agarre suavemente el ratón, inyecte ketamina (50 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p) para anestesia, e inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia.
- Asegure la profundidad de la anestesia con un pellizco en los dedos de los pies, afeite el vello en toda el área del abdomen con una navaja y coloque el ratón en la plataforma quirúrgica estéril bajo el microscopio quirúrgico con un aumento de 6-10x.
>2. Recolección de bazo del donante
- Esterilice el abdomen con una almohadilla de preparación con alcohol, asegure las extremidades con cinta quirúrgica y haga una incisión vertical de 3-4 cm en la línea media de la piel desde el pubis hasta la apófisis xifoides con unas tijeras.
- Retraiga la pared abdominal con retractores estériles hechos con clips. Mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen (lado izquierdo del cirujano) con un hisopo de algodón estéril para exponer el bazo. Cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo con una cauterización estéril a baja temperatura (Figura 1A). Coloque un trozo de gasa estéril empapada con solución salina a 37 °C sobre el bazo para mantenerlo húmedo (Figura 1B).
- Separar y movilizar la vena porta del tejido pancreático (Figura 1C) ligando las ramas de la vena porta (vena pancreaticoduodenal superior y vena gástrica derecha); colocar una sutura alrededor de la vena porta distal de la vena esplénica (Figura 1D).
- Voltea el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y el tronco celíaco con la arteria esplénica (Figura 1E). Diseccionar y movilizar la arteria aórtico-celíaca-esplénica mediante ligadura de la arteria hepática y la arteria gástrica; colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la arteria celíaca (Figura 1F-G).
- Inyecte 100 unidades internacionales (UI) de heparina en la vena cava inferior (IVC) para heparinizar todo el cuerpo y espere 3 minutos para asegurarse de que la heparina haga efecto. Ligradar la aorta proximal a la arteria celíaca, seccionar la vena porta y luego perfundir todo el cuerpo con 10 mL de solución salina heparinizada fría (4 °C) (10 mL/20 s) desde la aorta abdominal distal al tronco celíaco (Figura 1H).
- Recoja el injerto de bazo en bloque con el segmento aórtico-celíaco-esplénico asociado y la vena porta junto con un segmento de vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. Conservar el injerto en 5 mL de solución salina a 4 °C antes del trasplante. Eutanasia del ratón por luxación cervical.
>3. Esplenectomía del receptor e implantación de injerto de bazo
- Coloque una almohadilla térmica en la plataforma quirúrgica y ajuste la temperatura a 37 °C. Coloque un paño estéril (45,7 cm x 66 cm) encima de la almohadilla térmica para crear una plataforma quirúrgica estéril. Repita los pasos 2.1 y 2.2 para la preparación quirúrgica y la anestesia. Haga una incisión de 3-4 cm en la línea media y retraiga la pared abdominal como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
- Mueva con cuidado el intestino hacia el lado derecho del ratón con un hisopo de algodón estéril para exponer el bazo del receptor. Ligara la vena y la arteria esplénica y extirpa el bazo.
- Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del ratón y cubra los intestinos con una gasa húmeda (empapada con solución salina estéril a 37 °C). Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarrenal y de la VCI; Pinzamiento cruzado de la aorta infrarrenal y la VCI mediante el uso de dos pinzas microvasculares de 4 mm.
- Coloque una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarrenal (un espesor completo) y retraiga para crear una aortotomía elíptica mediante un solo corte con microtijeras (la longitud debe coincidir con el diámetro de la aorta donante, Figura 2A). Perfore la VCI con una aguja de 30 G para crear una venotomía elíptica y extienda la abertura hasta la longitud de la vena porta del donante con unas tijeras (Figura 2A).
- Eliminar la sangre intraluminal o el coágulo sanguíneo (en la aorta y en la VCI) con 500 μL de solución salina heparinizada (10 unidades/mL).
- Coloque el injerto de bazo en el flanco derecho del abdomen del ratón receptor; identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta del donante. Después de asegurarse de que los vasos no estén retorcidos, cubra el injerto de bazo con una gasa empapada con solución salina fría (4 °C).
- Conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortaotomía del receptor con dos suturas de estancia (sutura de nylon 11-0, igual que a continuación) (Figura 2B, C). Realizar una anastomosis con 2-3 mordidas de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la aortaotomía (pared anterior) del receptor (Figura 2D). Voltee el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor; realizar la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la aortotomía (pared posterior) del receptor (Figura 2E).
- Realizar una anastomosis para conectar la vena porta del donante a la pared posterior de la VCI del receptor, utilizando de 4 a 5 mordidas de suturas continuas en el interior de la VCI y luego cerrar la sutura en el exterior de la VCI (Figura 2F, G).
- Suelte las pinzas de los vasos y use un hisopo de algodón estéril para taponar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo (Figura 2H).
- Cierre el abdomen con una sutura de vicryl sintético absorbible 5-0 en un patrón continuo. Cierre la capa de piel con una sutura de nailon 5-0 en un patrón interrumpido.
nota: Para los pasos 3.7-3.8, alternativamente, realice primero una anastomosis entre la vena porta del donante y la VCI del receptor (paso 3.8); A continuación, realizar una anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía del receptor, utilizando 2 o 3 suturas continuas en el interior de la aorta y cerrar la sutura en el exterior de la aorta.
4. Recuperación de animales
- Inyecte 1 mL de solución salina tibia por vía subcutánea a través de 4 lugares separados (0,25 mL/ubicación) después de cerrar el abdomen.
- Mantenga el ratón en una incubadora con temperatura controlada (30 °C) durante las primeras horas después de la operación, controle al ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente y luego transfiera el ratón a una nueva jaula limpia con comida y agua regulares, con una almohadilla térmica (30 °C) debajo de la jaula. Mantenga al ratón después de la cirugía en una jaula separada.
>5. Manejo del dolor postquirúrgico
- Inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea 24 h y 48 h postoperatorio para mantener la pauta de analgesia.
