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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de reservas cuantificadas de glicerol de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) danés y Mycobacterium tuberculosis H37Rv
NOTA: Todos los protocolos descritos se realizaron en condiciones de nivel de bioseguridad 3 (BSL3).
- Descongele las existencias congeladas de glicerol de las cepas BCG danesas o H37Rv e inocule 100 μl en 10 ml de medio 7H9 suplementado con Tween-80 0,05% (v/v) y ADC (albúmina, dextrosa, catalasa) 10% (v/v).
- Incubar en condiciones estáticas durante una semana a 37 °C hasta que el cultivo esté en fase de crecimiento logarítmico.
- Amplíe el cultivo bacteriano transfiriendo el cultivo de 10 ml a 200 ml de medio fresco. Incubar durante 20 días adicionales en condiciones estáticas.
- Transfiera a tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugue durante 15 min a 2500 x g.
- Deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender la pelletización bacteriana en el volumen residual. Agregue perlas de vidrio estériles de 3 mm de diámetro a cada tubo (10 - 15 por tubo).
- Agite vigorosamente durante 1 minuto para disociar los grupos bacterianos. Vuelva a suspender cada pellet en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Tween-80 al 0,05% (v/v).
- Deje los tubos durante 10 minutos para permitir que se asienten los agregados bacterianos más grandes y las perlas de vidrio.
- Recuperar 9,5 ml de sobrenadante de cada uno de los 4 tubos que contienen pequeños grumos y bacterias individuales y transferir los volúmenes a un solo tubo de centrífuga fresco de 50 ml (volumen final recuperado de 38 ml). Centrífuga durante 10 min a 400 x g.
- Recuperar 35 ml de sobrenadante (que contiene principalmente bacterias individuales) en un solo tubo de centrífuga fresco de 50 ml y añadir 15 ml de PBS con glicerol al 50% (v/v), obteniendo una concentración final de glicerol del 15% (v/v).
- Mezclar suavemente y distribuir en alícuotas de 1 ml en tubos apropiados para la congelación. Almacenar a -80 °C (un lote proporciona aproximadamente 50 alícuotas de caldo de glicerol).
- Para cuantificar las reservas de glicerol, descongele el glicerol al día siguiente de la congelación y realice siete diluciones en serie de diez veces en tubos separados de 1,5 ml que contengan 900 μl de PBS.
- Placa de 100 μl de cada dilución en medio agar sólido 7H10 suplementado con ADC 10% (v/v) preparado en placas de Petri de 55 mm de diámetro.
- Agregue con cuidado perlas de vidrio de 3 mm de diámetro (aprox. 10 por plato) y agite suavemente el plato para distribuir uniformemente el volumen sobre el plato de agar. Deseche las perlas y selle la placa de agar con parafilm.
- Incubar durante 21 días a 37 °C y determinar la concentración bacteriana contando las unidades formadoras de colonias (UFC) en las diluciones en las que se pueden distinguir con precisión colonias individuales.
>2. Vacunación de ratones
- Descongele un glicerol BCG precuantificado y dilúyalo en PBS para preparar dos suspensiones. Calcular el volumen final considerando que la dosis por animal es de 100 μl para la administración subcutánea (107 UFC por ml para la vacunación subcutánea) y 40 μl para la administración intranasal (2,5 x 107 UFC para la vacunación intranasal).
- Utilice una estación de trabajo de anestesia especializada para roedores para anestesiar ratones con una mezcla de isoflurano y oxígeno. Utilice isoflurano al 5% para inducir la anestesia y al 2% para mantener a los ratones en la cámara de anestesia. (Se pueden utilizar otros métodos de anestesia aceptados).
- Para la administración subcutánea de la vacuna, llene una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G con 1 ml de suspensión bacteriana (10,7 UFC/ml). Elimina las burbujas de aire.
- Coloque un ratón anestesiado sobre una superficie plana en posición prona dentro de una campana de flujo laminar e inocule por vía subcutánea 100 μl (106 UFC/dosis) de vacuna en un flanco de la espalda del ratón. Regrese el ratón a la jaula y vigílelo para asegurarse de que se recupere adecuadamente de la anestesia.
- Cambie la aguja de la jeringa entre cada administración de ratón. Se han eliminado las burbujas de aire como se ha descrito anteriormente.
- Para la administración intranasal, coloque un ratón anestesiado en posición supina dentro de la capucha.
- Con una micropipeta, tome 20 μl de la suspensión con 2,5 x 107 UFC/ml. Coloque el inóculo gota a gota entre las dos fosas nasales hasta que se haya depositado todo el volumen, dejando tiempo entre gotas para permitir que el ratón respire el volumen.
NOTA: los ratones pueden sufrir dificultad respiratoria durante este procedimiento, por lo que se les debe dejar asimilar cada gota antes de administrar la siguiente para prevenirla en la medida de lo posible.
- Vuelva a llenar la micropipeta con otros 20 μl y repita la operación. Si el ratón comienza a despertar de la anestesia después de la primera inoculación, colóquelo en la cámara de anestesia antes de la segunda. Regrese el ratón a la jaula y asegúrese de que se recupere adecuadamente de la anestesia.
>3. Desafío intranasal de ratón con cepa H37Rv
- Descongelar un glicerol H37Rv precuantificado y diluirlo en PBS para preparar una suspensión bacteriana de 2.500 UFC por ml. Calcular el volumen final considerando que la dosis por animal es de 40 μl.
- H37Rv se inocula por vía intranasal como se describe en 2.5 - 2.7. La dosis final de desafío por ratón es de 102 UFC/40 μl.