Generación de la desmielinización cortical cerebral generalizada en un modelo de rata

Resumen

Fuente: Üçal, M. et al., Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citocinas proinflamatorias. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra un método para generar un modelo de rata con desmielinización cortical cerebral generalizada. Esto implica la interrupción de la barrera hematoencefálica mediante la inyección de citoquinas proinflamatorias en ratones preparados con proteína de vaina de mielina recombinante. Este proceso facilita la infiltración de células inmunitarias, lo que da lugar a una desmielinización cortical cerebral generalizada.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de materiales

NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. Antes de comenzar, asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos, incluidas las brocas, se limpien con un desinfectante adecuado.

1. Prepare una mezcla anestésica: 0,02 mg/mL de fentanilo, 0,4 mg/mL de midazolam y 0,2 mg/mL de medetomidina (concentraciones finales en la mezcla).
   NOTA: Consulte la sección de Discusión respectiva para conocer los anestésicos alternativos.
2. Prepare una mezcla de antídotos: 0,07 mg/mL de flumazenil y 0,42 mg/mL de atipamezol (concentraciones finales en la mezcla).
3. Ensamble el catéter y la tapa del catéter con la entrada y el tornillo. Corte el catéter a una longitud de 2 mm con un bisturí (Figura 1).
   NOTA: No utilice tijeras para esto, ya que aprietan y distorsionan la forma de la sección transversal circular de la punta del catéter.

>2. Preparación quirúrgica

1. Anestesiar a la rata mediante una administración intraperitoneal de la mezcla anestésica (1,5 mL/kg de peso corporal).
2. Afeita la cabeza de la rata entre las orejas con la afeitadora eléctrica. Coloque una manta homeotérmica en el marco estereotáctico antes de colocar al animal, para evitar la hipotermia durante toda la cirugía.
3. Inmovilice la cabeza de la rata en el marco estereotáctico usando las barras para las orejas y la placa de mordida, asegurándose de que la cabeza esté horizontal y estable. Verifique la estabilidad aplicando presión en el cráneo con el dedo o con fórceps.
   NOTA: Una fijación floja y un posicionamiento no horizontal dentro del marco estereotáctico pueden causar una desviación de las coordenadas previstas.
4. Aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía. Cubra los ojos con un material opaco para evitar cualquier exposición a la luz quirúrgica.
5. Limpiar la zona afeitada alternando la aplicación de un 70% de etanol y un 10% de povidona y un 10% de complejo yodado.
   NOTA: Siga todas las medidas de precaución durante la cirugía para evitar infecciones. La cirugía se realiza en condiciones asépticas. Si se rompe la asepsia, entonces el material contaminado debe ser reemplazado.

>3. Implantación de catéteres

1. Realiza una incisión longitudinal de unos 2 cm de longitud en el centro de la piel de la cabeza. Use pinzas de bulldog para sujetar la piel hacia los lados. Para obtener información general sobre estos pasos, consulte la figura 2.
2. Retira la sangre con un aplicador con punta de algodón.
3. Extirpar el periostio del cráneo. Limpie el pañuelo con el aplicador de punta de algodón y exponga el hueso del cráneo. Deje que el cráneo se seque durante aproximadamente 1 minuto.
4. Identifique los puntos de referencia anatómicos, Lambda, Bregma y sutura medial. Con el taladro instalado en el marco estereotáctico, coloque la punta del taladro en el Bregma como punto de partida. Muévase 2 mm hacia atrás desde el Bregma y mueva ~2,4 mm lateralmente hasta la sutura medial.
5. Taladre un orificio de 0,5 mm de diámetro para el catéter en esta posición. Sople suavemente el polvo de los huesos.
   NOTA: Es importante que la duramadre permanezca intacta durante la perforación. Para asegurar esto, 1) use un taladro que se pueda instalar en el marco estereotáctico, 2) inspeccione el orificio con frecuencia durante la perforación y 3) profundice en pequeños pasos. Si se aplica demasiada presión al cráneo, la punta del taladro continuará y dañará el cerebro cuando el cráneo esté completamente penetrado.
6. Taladre 3 agujeros más (~1,3 mm de diámetro) para los tornillos de anclaje a unos milímetros del primer agujero. Sople suavemente el polvo de hueso.
   NOTA: Seleccione ubicaciones de tornillos de anclaje que proporcionen suficiente espacio para la parte superior del catéter (~2 mm de diámetro) y las tapas de los tornillos de anclaje (~1 mm).
7. Elimine el polvo óseo mediante irrigación con alrededor de 1 a 2 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica con una jeringa. Limpia el cráneo. Apriete los tornillos de anclaje de 2 a 3 vueltas completas.
   NOTA: Los tornillos de anclaje son necesarios para estabilizar la instalación sujetando el cemento dental y, por lo tanto, el catéter en su lugar. Al apretar un tornillo de anclaje, asegúrese de que no se pueda quitar fácilmente levantándolo suavemente hacia arriba con pinzas. Dado que la implantación del catéter en sí misma causa un traumatismo tisular, una lesión adicional de la duramadre al perforar o apretar los tornillos de anclaje provocará múltiples lesiones traumáticas y posiblemente dificultará la comparabilidad dentro de un grupo. Apriete primero los tornillos de anclaje e inserte el catéter al final.
8. Inserte el catéter de 2 mm de longitud a través del primer orificio, perpendicular a la superficie del cráneo. Mientras aún sostiene el catéter, aplique un poco de cemento dental y deje que se polimerice con una breve exposición (~ 5 s) a la luz de curado dental para estabilizar el catéter, permitiendo el uso de ambas manos en el siguiente paso.
   cautela: Al trabajar con una lámpara de polimerización dental, evite mirar directamente a la punta o a la luz reflejada desde el área de aplicación, ya que la alta intensidad de esta luz puede causar daños en la retina. Utilice gafas protectoras adecuadas.
9. Aplique más cemento dental alrededor del catéter, ancle los tornillos y solidifique el cemento dental con la luz de polimerización dental (~15 - 30 s). Confirme el endurecimiento del cemento con la punta de una pinza.

>4. Cierre de la herida y antagonización de la anestesia

1. Cierre la piel de la cabeza con suturas reabsorbibles, anterior y posterior al catéter.
   NOTA: Dado que habrá una configuración irregular sobre el cráneo al final de la implantación, cierre la herida en consecuencia. Levantar demasiado la piel provocará molestias para el animal.
2. Inyecte la mezcla de antídoto por vía subcutánea (1,5 mL/kg de peso corporal) utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de 26 G.
3. Administrar enrofloxacino (2,5%) por inyección subcutánea (7,5 mg/kg de peso corporal) para el tratamiento antibiótico profiláctico. Administrar carprofeno (1 mg/mL; 5 mg/kg de peso corporal) y buprenorfina (1,2 mg/kg) para el alivio del dolor mediante inyección subcutánea.

>5. Cuidados postoperatorios y medicación

1. Devolver el animal a la jaula modificada y mantenerlo en observación durante 1 a 3 h, con aplicación de luz infrarroja para evitar la hipotermia, observando y reposicionando constantemente al animal cada 5 a 10 minutos hasta la recuperación postoperatoria. Tenga especial cuidado de evitar la exposición constante de luz a los ojos hasta la recuperación.
2. Repetir las administraciones de enrofloxacino (7,5 mg/kg de peso corporal) y carprofeno (1 mg/mL; 5 mg/kg de peso corporal) mediante inyecciones subcutáneas el día después de la cirugía. No es necesario refrescar la buprenorfina, ya que el tratamiento anterior es eficaz durante 72 horas.

>6. Preparación de la mezcla de inmunización (como muy pronto 14 días después de la implantación del catéter)

NOTA: Coloque las jeringas en hielo durante el procedimiento de preparación.

1. Conecte dos jeringas de vidrio con punta de bloqueo Luer de 10 mL a los brazos cortos de una llave de paso de 3 vías y cierre la tercera salida con el brazo largo.
2. Asegúrese de que las conexiones estén seguras y sin fugas: agregue aproximadamente 4 ml de PBS estéril a la jeringa abierta mientras sostiene el pistón 2. Inserte el pistón 1 y empuje ambos pistones hacia adelante y hacia atrás mientras verifica si hay fugas. Si no se produce ninguna fuga, deseche el PBS y vuelva a retirar el pistón 1.
3. Pipetear 1 mL de adyuvante de Freund incompleto (IFA) y 50 μg de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina recombinante (rMOG_1-125) juntos y ajustar la mezcla a un volumen final de 2 mL con PBS estéril (pH 7,4) en un tubo adecuado.
   NOTA: Debido a las pérdidas de emulsión en las puntas o paredes de las jeringas durante la preparación, prepare un volumen mayor que el previsto para la administración. Del mismo modo, es más práctico prepararse para más de 1 animal a la vez.
4. Coloque la mezcla diluida de IFA y rMOG_1-125 en la jeringa abierta. Inserte el pistón suavemente mientras mantiene una presión suelta sobre el pistón opuesto (Figura 3A).
5. Emulsione el inóculo conduciéndolo de una jeringa a la otra empujando los pistones hacia adelante y hacia atrás hasta que esté blanco y viscoso (Figura 3B).
6. Fije una jeringa de bloqueo Luer de 1 mL al brazo corto abierto de la llave de paso de 3 vías y llénela con inóculo (Figura 3C). Distribuya todo el inóculo en jeringas de 1 mL. Manténgalo en hielo hasta la inyección. Administrar la mezcla el día de la preparación.

7. Inmunización

1. Anestesiar a la rata con isoflurano en una cámara (~2 min, mezclado con oxígeno 2 L/min) y luego mantener la anestesia a través de una máscara (mezclada con oxígeno 1,5 L/min).
2. Inyectar 200 μL de inóculo por vía subcutánea en la base de la cola con una aguja de 21 G.
   NOTA: Administre la inyección lentamente ya que la solución es viscosa.

>8. Inyección intracerebral de citoquinas

1. Ajuste la longitud de la cánula del conector (2 mm). (Consulte la Figura 4 para ver los pasos de preparación).
2. Llene una jeringa de 1 mL con la mezcla de citocinas (500 ng/μL de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), 300 U/μL de interferón gamma recombinante de rata (IFN-gamma) en PBS estéril). Conecte la jeringa a una cánula conector. Llene la cánula con la mezcla de citocinas. Evite las burbujas.
3. Monte la jeringa en la bomba de jeringa programable y prográmela para inyectar 0,2 μL/min (Figura 5A). Ponga en marcha la bomba y manténgala en funcionamiento para evitar la formación de burbujas de aire en la punta de la cánula.
   NOTA: La velocidad de inyección debe tener en cuenta el diámetro interior de la jeringa específica utilizada; De este modo, se debe registrar el diámetro de la jeringa durante la puesta en marcha de la bomba.
4. Anestesiar a la rata con isoflurano en una cámara (~2 min, mezclado con 2 L/min de oxígeno) y luego mantener la anestesia a través de una máscara (mezclada con 1,5 L/min de oxígeno) (Figuras 5B y 5C). Aplique gotas lubricantes para los ojos, ya que el animal estará anestesiado durante al menos 30 minutos.
5. Retire la tapa del catéter con la entrada. Inserte la cánula del conector en el catéter y atorníllela y apriétela (Figuras 5D y 5E).
   NOTA: No lo apriete demasiado, ya que esto destruirá la punta superior del catéter.
6. Deje que la inyección continúe durante 10 minutos (siendo el volumen total de la inyección de 2 μL). Detenga la bomba. Deje la cánula dentro del catéter durante 20 minutos para permitir que el volumen inyectado se difunda por completo.
7. Desenrosque la cánula del conector y retírela lentamente para evitar un efecto de vacío.
8. Vuelva a colocar la tapa del catéter en la entrada y atorníllelo. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula.

Resultados

Figura 1: Preparación del catéter. (A y B) La cánula guía y la cánula ficticia (tapón del catéter con entrada) están ensambladas y atornilladas. (C) A continuación, se corta el catéter a 2 mm de tamaño con la ayuda de un bisturí. La observación microscópica mostró que el uso de tijeras para ese propósito distorsiona la forma circular de la punta de l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratas Agutí Oscuras macho adulto (300 ±25 g)
fentanilo	Hameln pharma plus, Alemania		Como fentanilo-citrato, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Austria	50039017	5 mg/ml
Medetomidina	Orion Pharma, Finlandia		Como clorhidrato de medetomidina, 1 mg/ml
Flumazenil	Roche, Suiza		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlandia		Como clorhidrato de Atipamezol, 5 mg/ml
Complejo povidona-yodo al 10%	Mundipharma, Austria
Cemento dental	Heraeus Kulzer, Alemania	6603 7633
Solución salina fisiológica	Fresenius Kabi, Austria		0.9% NaCl
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, Alemania	P3813
Isofluorano	AbbVie, Austria
Gotas lubricantes para los ojos	Thea Pharma, Austria
70% EtOH	Merck, Alemania	1070172511	El etanol absoluto se diluyó en ddH2O para la preparación de 70% v/v
2.5% Enrofloxacina	Bayer, Alemania		Antibióticos profilácticos
Carprofeno	Pfizer, Estados Unidos		Analgésicos, 50 mg/ml
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich, Alemania	P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Austria		Pentobarbital sódico, 400 mg/ml
Interferón gamma	PeproTech, Estados Unidos	400-20
Factor de necrosis tumoral alfa	R&D Systems, EE.UU.	510-RT-050/CF
rMOG1-125	producto propio en el Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska, Suecia		Glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de rata recombinante, aminoácidos 1-125 del extremo N-terminal, también disponible comercialmente: AnaSpec, AS-55152-500, EE. UU.
Adyuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich, Alemania	F5506
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich, Alemania	A9576
Solución de sustrato de peroxidasa	Laboratorios de vectores, EE. UU.	SK-45000
Marco estereotáctico	David Kopf Instruments, Estados Unidos
Catéteres, adecuados para resonancia magnética	PlasticsOne, Estados Unidos	8IC315GPKXXC
Cánulas ficticias	PlasticsOne, Estados Unidos	8IC315DCNSPC
Tornillos de plástico, aptos para resonancia magnética	PlasticsOne, Estados Unidos	8L080X093N01
Cánula de conector	PlasticsOne, Estados Unidos	8IC313CXSPCC
Destornillador con punta de 2 mm
Taladro con extensión de eje flexible	Proxxon, Alemania	Nº 28.472, N.º 28.706, N.º 28.620,
Broca, redonda, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Alemania	REF310 104 001 001 009
Broca, retorcida, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Alemania	REF350 104 417 364 013
escalpelo	Braun, Alemania	BB510
Mango de bisturí	Fine Science Tools, Alemania	91003-12
Aplicador de punta de algodón	Henry Schein Medical, Austria	900-3155
Tijeras quirúrgicas	Fine Science Tools, Alemania	14101-14, 14088-10
Pinzas quirúrgicas	Fine Science Tools, Alemania	11002-12, 11251-35
Abrazaderas Bulldog	Fine Science Tools, Alemania	18050-35
Manta homeotérmica	Sistemas TSE, Alemania
Lámpara infrarroja	Beurer, Alemania	616.51
Lámpara de polimerización dental	Guilin Woodpecker Medical, China
Sutura reabsorbible	Johnson & Johnson, Bélgica	V792E
Bomba de jeringa programable	World Precision Instruments, EE. UU.	AL-1000
Guantes de examen
Bata quirúrgica
Afeitadora eléctrica	Aesculap, Alemania	GT420
Vaporizador anestésico volátil	Rothacher Medical, Suiza	CV 30-301-D
Fuente de oxígeno para vaporizador de anestésicos volátiles	Air Liquide, Austria	19.113
Cámara de anestesia volátil	Rothacher Medical, Suiza	PS-0347
Mascarilla de anestesia para ratas	Rothacher Medical, Suiza	PS-0307-A
Jeringa de 1 ml	Codan, Dinamarca	REF 62.1612
Aguja de calibre 26 para inyección	Braun, Alemania	4657683
Aguja de calibre 20 para inyección de citocinas e inmunización	Braun, Alemania	4657519
Jeringas de vidrio con punta Luer Lock	Poulten & Graf, Alemania	7.140-37
Llave de paso de 3 vías	Becton Dickinson, Suecia	394600
Incubadora a 37 °C	Kendro, Alemania	50042301
Micropipetas	Gilson, Estados Unidos	F167350