Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Esterilización
- Desinfecte las pinzas antes de recoger las cabezas tomando pinzas limpias y realizando la esterilización por calor seco en un horno a 200 °C durante 1 h. Autoclave toda la cristalería a 121 °C durante 15 min antes de su uso.
- Realizar todos los trabajos descritos dentro de un gabinete de microbiología clase 2. Prepare todos los reactivos según las instrucciones del fabricante.
>2. Recogida de muestras
- En el matadero, los corderos Swaledale se sacrificaban mediante aturdimiento con electricidad o una pistola de cerrojo cautivo y se desangraban. Recoja las cabezas de cordero no más de 4 horas después del sacrificio.
>3. Preparación de las cabezas
- Desinfecte la sección de la frente del cordero vertiendo aproximadamente 100 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm sobre el área de la muestra. Afeita la sección de la frente de la cabeza con una maquinilla eléctrica y lava el área con 200 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm.
- Limpie el área con etanol y rollo azul y cubra el área de la muestra con crema depilatoria durante 35 min. Raspe suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúe el área de la muestra. Si queda una cantidad significativa de vello, repita el proceso de depilación.
- Use otros 200 ml de solución de dióxido de cloro para enjuagar el área, y luego enjuague con etanol y limpie con un panecillo azul.
- Con un punzón de biopsia estéril de 8 mm, corte muestras de piel de 8 mm del área preparada. Extraiga las muestras con pinzas estériles y un bisturí de 15 hojas, asegurándose de eliminar toda la grasa cutánea.
- Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 L lleno de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y luego transfiéralas a tubos estériles de 50 mL con 50 mL de solución de dióxido de cloro de 200 ppm, invierta dos veces y deje esterilizar durante 30 minutos.
- Retire las muestras de la solución de dióxido de cloro y lávelas colocándolas en un tubo de 50 ml lleno de 40 ml de PBS estéril. Una vez lavado, coloque cada muestra de piel individual en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos.
- Añada 350 μL de medio precalentado mientras mantiene la muestra en la interfaz aire-líquido. La composición de los medios es la siguiente: medios MK (Medio 199 con sales de Hanks, L-glutamato y 1,75 mg/mL de bicarbonato sódico) y F12 de Ham en una proporción 1:1, con suero fetal bovino añadido (FBS, 10% v/v), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL), y anfotericina B (2,5 μg/mL).
- Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas e incube a 37 °C en una incubadora de tejido humidificada al 5% de CO2 durante un máximo de 24 h.
>4. Mantenimiento de muestras de piel
- Después de la incubación, retire el medio de cultivo y enjuague las muestras con 500 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Añada medios libres de antibióticos a cada muestra e incube a 37 °C en una incubadora de tejido humidificada al 5% deCO2 durante 24 h para eliminar los antibióticos residuales de la muestra.
- Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en el medio libre de antibióticos después de 24 h, deseche la muestra.
5. Preparación del inóculo
- Prepare un tubo de 50 mL con 10 mL de caldo de soja tríptico estéril. Tome una placa de agar fresca de S. aureus y use un hisopo para transferir varias colonias al caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
- Centrifugar a 4.000 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 mL de PBS estéril. Repita dos veces para asegurar un lavado adecuado de las células.
- Ajuste el inóculo a 0,6 OD600 en PBS estéril. Confirme la carga de inóculo mediante la realización de un recuento manual de placas viables.
>6. Infección de muestras de piel
- Prepare una placa nueva de 24 pocillos con 400 μL de medios precalentados sin antibióticos y agregue los insertos de 24 pocillos con pinzas estériles.
- Retire el medio de las muestras de piel, lávese con 500 μL de PBS estéril y retire el lavado. Use pinzas estériles para sujetar suavemente la muestra al fondo del pocillo.
- Utilice una biopsia con sacabocados de 4 mm para hacer un colgajo central de la herida, perforando hasta una profundidad aproximada de 1-2 mm. A continuación, utiliza un bisturí de 15 hojas y unas pinzas de tejido allis dentado estéril para retirar la capa superior del colgajo de la herida. La variabilidad en las dimensiones de la herida puede afectar el resultado de la infección y las unidades formadoras de colonias (UFC) del punto final.
- Una vez que se hayan herido todas las muestras, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos con pinzas estériles. Pipetear 15 μL del inóculo bacteriano en el lecho de la herida. A continuación, incubar durante 24 h a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada con 5% deCO2.
- Si son necesarios períodos de incubación más largos, retire el medio y reemplácelo con medio nuevo cada 24 h e incube en las mismas condiciones.
