Una técnica para la edición de genes en células asesinas naturales utilizando CRISPR Cas9

Resumen

Fuente: Naeimi Kararoudi, M., et al. Generación de células NK humanas primarias y expandidas knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para la modificación genética mediada por la ribonucleoproteína Cas9 de células asesinas naturales primarias (NK). Una ribonucleoproteína Cas9, que consiste en una endonucleasa Cas9 unida a un ARN guía (ARNg) formado por el emparejamiento de bases de un ARN CRISPR (ARNcr) y un ARNc transactivador (ARNtrac), se introduce en las células asesinas naturales primarias mediante electroporación. La ribonucleoproteína se dirige y escinde el ADN del huésped en el sitio objetivo, lo que lleva a la eliminación del gen a través de la modificación del gen objetivo a través de la maquinaria de reparación celular.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Purificación y expansión de células NK humanas

1. Aísla células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de Buffy Coat.
   1. Coloque 35 mL de muestra de pelaje leucocitario sobre 15 mL de Ficoll-Paque.
   2. Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin freno y recoger el PBMC de la interfaz.
   3. Lave las PBMC recuperadas tres veces agregando al menos un volumen igual de PBS, centrifugando a 400 x g durante 5 minutos y aspirando el lavado de PBC. La célula NK puede ser aislada en esta etapa por RosettesSep.
2. Expanda las células NK estimulando con células alimentadoras que expresan 10 x 10⁶ mbIL21 irradiadas en los días 0, 7 y 14. Reemplace los medios con RPMI nuevos que contengan 10 % de FBS, 1 % de glutamina, 1 % de penicilina estreptomicina y 100 UI/mL de IL-2 para todo el volumen de medios cada dos días.

>2. Diseño y selección de ARNg

1. Elija los loci genómicos específicos a los que dirigirse, utilizando herramientas en línea, por ejemplo, NCBI, Ensemble.
   ejemplo.
   Descripción: Factor de crecimiento transformante beta receptor 2 (TGFBRR2) ectodominio
   Ver registro: PF08917
   Ver InterPro: IPR015013
   Posición: 49 - 157 aa
   Secuencia dirigida: Exón 4 del gen TGFBR2 (ENSG00000163513)
2. Para diseñar los ARNg, utilice herramientas web de diseño CRISPR como http://crispr.mit.edu y 'Benchling'.
   1. Introduzca la secuencia de ADN elegida en el paso 2.1. Elija el genoma humano (hg 19) como genoma objetivo. Las guías CRISPR (20 nucleótidos seguidos de una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM): NGG) se escanearán a partir de la secuencia introducida anteriormente. También muestra posibles coincidencias fuera del objetivo en todo el genoma seleccionado.
   2. Elija los tres mejores ARNg que tengan la puntuación más alta, en función de sus tasas en el objetivo y fuera del objetivo. Por ejemplo, la Tabla 1 muestra los ARN CRISPR diseñados para dirigirse al exón 4 del gen TGFBR2 sugeridos por las herramientas web de diseño de CRISPR.
3. Pida los ARN CRISPR como ARNc sintéticos específicos de secuencia.
4. Ordenar a un ARN conservado y transactivador (tracrRNA) que interactúe a través de homología parcial con el crRNA.

>3. Diseño de imprimaciones de cribado de deleción

1. Diseñe cebadores que abarquen los sitios de escisión del ARNg para el ensayo de mutación T7E1.
2. Utilice cebadores a una distancia mínima de 100 pb del sitio de escisión previsto para garantizar que aparezcan pequeñas inserciones-deleciones (indels) en el sitio objetivo del sgRNA en el gel de agarosa al 1,5% después del ensayo de mutación. En la Tabla 2 se muestran los cebadores que se utilizan para amplificar el ectodominio TGFBR2.

>4. Transducción de células NK primarias y expandidas humanas

>Nota: La transducción de elementos Cas9/RNPs en NK se realiza por electroporación utilizando el sistema 4D de la siguiente manera.

1. Preparación de la célula
   1. Para las células NK primarias, incubar las células NK recién aisladas en un medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en presencia de 100 UI/mL de IL-2 durante 4 días y realizar la electroporación en el día 5. Reemplace el medio cada dos días como se describió anteriormente y el día antes de la transducción.
   2. En el caso de las células NK expandidas, estimule las células en el día 0 con células alimentadoras irradiadas en una proporción de 1:1 y realice la electroporación en el día 5, 6 o 7. Reemplace el medio cada dos días como se describió anteriormente y el día antes de la transducción.
   3. El día de la electroporación, prepare un matraz T25 lleno de 8 mL de RPMI fresco que contenga 100 UI/mL de IL-2 para las celdas en electroporación y preincube los matraces en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂><. nota: Las células descongeladas o las células que han sufrido una 2ª o 3ª estimulación pueden electroporarse en cualquier momento después de su recuperación, tal y como se ha descrito.
   4. Tome 3 - 4 × 10⁶ celdas por condición para 26 μL de mezcla de transducción.
      nota: La concentración muy alta de células NK en la solución de electroporación mejora la tasa de transducción.
   5. Lave las células 3 veces con PBS para eliminar todo el FBS, que comúnmente contiene actividad de ARNasa. Gírelos cada vez a 300 x g durante 8 minutos.
      nota: Considere 7 condiciones de electroporación para Cas/RNP como ARNg único (ARNg1, ARN2, ARNg3) y una combinación de dos ARNg (ARNg1+ARN2, ARN1+ARN3, ARN2+ARN3) y un control sin Cas9/RNP.
2. Formar el crRNA:tracerRNA/complejo
   1. Resuspenda los crRNAs (gRNA1, gRNA2 y gRNA3) y el ARNtracer en una solución de TE 1x hasta concentraciones finales de 200 μM. Mezcle 2,2 μL de cada ARNg de 200 μM con 200 μM de ARNtracer como se muestra en la Tabla 3.
   2. Calentar las muestras a 95 °C durante 5 min y dejar enfriar en la mesa a temperatura ambiente (15 - 25 °C). Almacene los ARN resuspendidos y el ARNcr: tracrRNA/complejo a -20 °C para su uso posterior.
3. Forma el complejo RNP
   Nota: Para ahorrar tiempo, forme el complejo RNP durante la etapa de lavado 4.1.5.
   1. Para la reacción dúplex de crRNA:tracrRNA simple, diluya la endonucleasa Cas9 a 36 μM, como se muestra en el ejemplo de la Tabla 4.
   2. Para la transducción combinada de dúplex crRNA:tracrRNA, diluya la endonucleasa Cas9 a 36 μM, como se muestra en el ejemplo de la Tabla 5.
   3. Agregue la endonucleasa Cas9 a los dúplex de crRNA:tracrRNA lentamente mientras gira la punta de la pipeta, durante 30 s a 1 minuto.
   4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 - 20 min. Si no está listo para usar la mezcla después de la incubación, manténgala en hielo hasta su uso.
4. electroporación
   1. Añadir todo el suplemento a la solución de electroporación P3 y mantenerla a temperatura ambiente.
   2. Vuelva a suspender el pellet de celda (3 - 4 × 10⁶ celdas del paso 4.1.5) en 20 μL de solución de electroporación 4D primaria P3. Evite las burbujas de aire durante el pipeteo.
      Nota: Las células no deben dejarse durante mucho tiempo en la solución P3.
   3. Añadir inmediatamente 5 μL de complejo RNP (Paso 4.3) a la suspensión celular.
   4. Agregue 1 μL de 100 μM de potenciador de electroporación Cas9 a la mezcla Cas9/RNPs/celda.
   5. Transfiera la mezcla de Cas9/RNPs/celda a tiras de electroporación de 20 μL.
   6. Golpee suavemente las tiras para asegurarse de que la muestra cubra la parte inferior de las tiras.
   7. Inicie el sistema de electroporación 4D y elija el programa EN-138.

Tabla 1. Tres ARNg diseñados para dirigirse al exón 4 del ectodominio TGFBR2 como ARNcr sintético.

ARNg NO.	Secuencia de ARNg	Ordenado como crRNA sintético
ARNg1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArUrGrUrCrU/AltR2/
ARNg2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrCrUrGrArGrCrUrCrU/AltR2/
ARNg3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

Tabla 2. Cebadores utilizados para amplificar el gen del ectodominio TGFBR2

TGFBR 2 ectodominio Primers FWD	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 ectodominio Primer REV	5 GGG CCT MORDAZA AAT CTG CAT TTA 3

Tabla 3. Formar el crRNA:tracrRNA/complex utilizando 200 μM de ARN

componente	Cantidad (uL)
200 μM de ARNcr	2.2
200 μM de ARN trazador	2.2
Búfer de IDTE	5.6
Producto final	10

Tabla 4. Para la reacción dúplex de crRNA:tracrRNA simple, diluya la endonucleasa Cas9 a 36 μM.

componente	Cantidad (μL)
Pbs	1
crRNA:tracrRNA dúplex (del paso 4.2)	2 (200 pmol)
Endonucleasa Alt-R Cas9 (61 μM de stock)	número arábigo
Volumen total	5 UL

Tabla 5. Para la transducción combinada de dúplex crRNA:tracrRNA, diluya la endonucleasa Cas9 a 36 μM.

componente	Cantidad (μL)
Pbs	1
crRNA:tracrRNA dúplex (por ejemplo, gRNA1)	1 (100 pmol)
crRNA:tracrRNA dúplex (por ejemplo, gRNA2)	1 (100 pmol)
Endonucleasa Alt-R Cas9	número arábigo
Volumen total	5 μL

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RosetteSep™ Cóctel de enriquecimiento de células NK humanas	Tecnologías STEMCELL	Año 15065	El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep™ está diseñado para aislar las células NK de la sangre total mediante selección negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Ciencias de la vida	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Tecnologías de ADN integradas	1072532	TracrRNA que contiene modificaciones químicas patentadas que confieren una mayor resistencia a la nucleasa. Se hibrida a crRNA para activar la enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Tecnologías de ADN integradas		Producido sintéticamente como alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basado en la secuencia de gRNA diseñado dirigido al gen de interés
Kit de detección de edición genómica Alt-R®	Tecnologías de ADN integradas	1075931	Cada kit contiene endonucleasa T7EI, tampón de reacción T7EI y controles de ensayo T7EI.
Platino® Taq ADN polimerasa de alta fidelidad	Invitrogen	11304-011
Sistema 4D-Nucleofector™	Lonza	AAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humana	Novartis	65483-0116-07
Kit P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X	Lonza	V4XP-3032	Contiene pmaxGFP™ Vector, Solución Nucleofectora™, Suplemento, Tiras de Nucleocuvette™ de 16 pocillos
No objetivo: siRNA personalizado, estándar 0,05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasa 3NLS	Tecnologías de ADN integradas	1074181	Cas9 Nucleasa
Manual de Sangre y Tejidos DNeasy®	Qiagen	69504
Mini Kit RNeasy	Qiagen	74104
Calceína AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Bioleyenda	580706
Kit de control Alt-R® CRISPR-Cas9, humano	Tecnologías de ADN integradas	1072554	Incluye tracrRNA, crRNA de control positivo HPRT, crRNA #1 de control negativo, mezcla de cebadores HPRT y tampón dúplex sin nucleasas.
IDTE pH 7.5 (1X Solución TE)	Tecnologías de ADN integradas	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Potenciador de Electroporación	Tecnologías de ADN integradas	1075915	Cas9 Potenciador de Electroporación