$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Generación de vacunas recombinantes contra la influenza vivas atenuadas mediante genética inversa
NOTA: El protocolo detallado para la generación de virus de influenza recombinantes por genética inversa ha sido descrito por estudios anteriores y está fuera del alcance de este informe. En resumen, el rescate de las vacunas contra la influenza adaptadas al frío (CAV) se realiza en un gabinete de clase II de bioseguridad bajo contención de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) e implica los pasos que se detallan a continuación.
- Generar una vacuna contra la influenza adaptada al frío utilizando como base la cepa A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) adaptada al frío, así como la hemaglutinina (HA) y una neuraminidasa (NA) modificada de la cepa A/PR/8/34 (H1N1) (Figura 1A). La modificación en el gen NA consiste en un reemplazo basado en PCR de una secuencia conservada en el tallo de la proteína (residuos 65 a 72) por una secuencia corta de ADNc que codifica el péptido derivado de la ovoalbúmina de pollo (OVA) SIINFEKL (Figura 1B). El péptido SIINFEKL es un péptido altamente inmunodominante en el contexto de la respuesta restringida H-2b MHC clase I de ratones C57BL/6.
- Placa 106 293T células por pocillo en placas de 6 pocillos utilizando DMEM 10% suero fetal bovino (FBS) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina (P/E).
- Prepare la mezcla de transfección de plásmidos: Agregue 1 μg de cada uno de los plásmidos que codifican ADNc para PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la cepa de influenza A/Ann Arbor/6/60 y 1 μg de los plásmidos que codifican para NA-SIINFEKL y HA de influenza A/PR/8/34. Añada Opti-medio esencial mínimo precalentado (Opti-MEM) (15 μl para un volumen final de 100 μl/pocillo).
- Incubar la mezcla de transfección durante 30 min en RT.
- Añadir 100 μl de mezcla/pocillo de transfección e incubar durante 16 horas a 37 °C y 5% de CO2.
- Cambie el medio de celda por DMEM: 0,3%, BSA, 1% P/E a 33 °C y 5% CO2 durante 5 horas.
- Agregue 106 células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) permisivas a la influenza en dimetilsulfóxido (DMSO) que contienen 1 μg/ml de tripsina de páncreas bovino tratado con L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK-tripsina). Mantener los cocultivos 293T-MDCK durante 2 - 3 días a 33 °C y 5% de CO2.
- Recoja los sobrenadantes de los cocultivos de células MDCK-293T y limpie por centrifugación a 260 x g durante 5 min.
