1. Generación de esferoides
- Prepare y autoclave agarosa al 2% en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, 1 g de agarosa en 50 mL de 1x PBS) y autoclave moldes de caucho de 35 y 81 micropocillos.
cautela: Evite el uso de agarosa de bajo punto de fusión para generar los moldes de agarosa para el procesamiento de inmunohistoquímica (IHC).
- Preparar moldes de agarosa
NOTA: Los moldes de 35 micropocillos se utilizan para ensayos de invasión, inmunofluorescencia (IF) y aislamiento celular. Los cilindros de 81 micropocillos se utilizan para ensayos de citotoxicidad, IHQ, aislamiento celular y extracción de ácido ribonucleico (ARN).
- Una vez que la agarosa se haya esterilizado en autoclave, deje que la agarosa fundida se enfríe a unos 60-70 °C. En una campana de cultivo celular, utilice la técnica aséptica y pipetee 500 μL de agarosa fundida en un molde de caucho de 81 micropocillos por pocillo o 330 μL en un molde de caucho de 35 micropocillos por pocillo.
cautela: Evite crear burbujas al mezclar o pipetear la agarosa. Elimine las burbujas pipeteando suavemente.
- Después de que la agarosa se solidifique, flexione con cuidado el molde de goma para eliminar el molde de agarosa. Por lo tanto, coloque las manos sobre la placa de pocillo apropiada y deje que el molde de agarosa caiga directamente en un pocillo de la placa de pocillo.
nota: Flexiona el molde de goma en diferentes posiciones para evitar que se flexione demasiado. Puede ser útil flexionar el molde de goma y empujar suavemente desde la parte inferior al mismo tiempo.
- Para equilibrar los moldes de agarosa, agregue un medio de cultivo celular, que consiste en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (2,5 mL/pocillo para la placa de 12 pocillos y 1 mL/pocillo para la placa de 24 pocillos). Coloque la placa de pocillo en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2) e incube durante 1 h.
- Mientras tanto, prepare el cultivo celular para la siembra.
nota: El número total de siembra de células por lance de agarosa debe ser decidido por el investigador. En el caso de las líneas celulares de cáncer de páncreas primario murino, se siembran 35.000 células/35 micropocillos y 81.000 células/81 micropocillos (en un promedio de 1000 células/esferoides) para todos los ensayos siguientes. El diámetro medio de un esferoide es de aproximadamente 150-200 μm después de 48 h.
- Retire primero el medio de cultivo celular que rodea el molde de agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa del pocillo. A continuación, retire con cuidado el medio en la cámara de siembra.
- Siembre cuidadosamente la suspensión de células tumorales preparada gota a gota en la cámara de siembra de células. Vuelva a colocar con cuidado la placa de pocillo en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO2) durante 15 min.
nota: Durante este paso, las células se asentarán en los micropocillos del molde de agarosa.
- Agregue medio adicional al exterior del molde de agarosa (2.5 mL/pocillo para la placa de 12 pocillos y 1 mL/pocillo para la placa de 24 pocillos).
- Vuelva a colocar la placa de pocillo en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO2) durante 48 h.
nota: Por lo general, las células tardan hasta unas horas en formar esferoides en los micropocillos. En general, los esferoides de células tumorales sólidas se forman después de 24 h y son estables después de 48 h. Sin embargo, esto puede variar entre las diferentes líneas celulares. Si es necesario, cambie el medio de cultivo celular inclinando cuidadosamente la placa de pocillos con los moldes de agarosa y retirando el medio de cultivo celular circundante con una pipeta P1000. Luego, agregue con cuidado el medio fresco pipeteándolo a lo largo de la pared del pozo. Por lo general, no es necesario cambiar los medios dentro de los moldes debido a su pequeño volumen y al riesgo de eliminar los esferoides.
>2. Cocultivo con células T
- Vuelva a suspender el número requerido de células T en 75 μL (molde de 35 micropocillos) o en 190 μL (molde de 81 micropocillos) del medio de cultivo de linfocitos T apropiado (RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10% y 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina).
- Retire primero el medio de cultivo celular que rodea el molde de agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa del pocillo. A continuación, retire lenta y cuidadosamente el medio dentro del yeso apuntando suavemente a una esquina de la cámara de siembra con una pipeta P200 mientras mantiene la placa del pocillo inclinada con la otra mano.
- (Paso crítico 1) Dado que existe el riesgo de eliminar los esferoides, controle la pérdida de esferoides comparando el número de esferoides dentro de los micropocillos antes y después de eliminar el medio observándolo bajo el microscopio con un aumento de 10x.
- Siembre con cuidado la suspensión de células T gota a gota en la cámara de siembra del molde de agarosa sosteniendo la pipeta P200 a unos 0,5 cm por encima del molde.
- (Paso crítico 2) Existe el riesgo de eliminar los esferoides mientras se agregan las células T. Por lo tanto, es fundamental agregar las células T muy lentamente y aproximadamente 0,5 cm por encima de la cámara de siembra.
nota: Una posibilidad de disminuir el número de esferoides expulsados es apuntar la pipeta a una esquina de la cámara de siembra mientras se añaden las células T, con lo que sólo se corre el riesgo de que los esferoides de esta esquina se eliminen.
- Vuelva a colocar con cuidado la placa de pocillos en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% de CO2) durante 15 min.
- Saque la placa del pocillo de la incubadora y agregue medio de cultivo celular fresco (medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con suero fetal bovino al 10% y 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina) alrededor del molde de agarosa pipeteándolo lentamente a lo largo de la pared del pocillo.
- Vuelva a colocar la placa de pocillo en la incubadora de cultivos celulares durante 48 h.
