Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Procedimiento para la Acucción
NOTA: La cantidad óptima de ADN y el área de la superficie de la piel objetivo pueden variar para diferentes genes y necesitan ser optimizados aún más. La fuerza de punción y el número de veces para aflojar la capa córnea de la piel también pueden variar según el grosor de la piel. Estas condiciones deben determinarse cuidadosamente después de evaluar el nivel de expresión de las transcripciones génicas ajustadas mediante qRT-PCR.
- Pesar los ratones y administrar tribromoetanol (400 μg por gm de peso corporal) mediante inyección peritoneal.
NOTA: El 2,2,2-tribromoetanol es un agente anestésico inyectable que se usaba comúnmente en ratones. Las soluciones se elaboran disolviendo un 2,2,2-tribromoetanol de grado no farmacéutico (2,5 g) en agua destilada (200 mL) que contiene 2,5% de 2-metil-2-butanol.
- Use ungüento oftalmológico veterinario en los ojos para prevenir la sequedad bajo anestesia.
nota: El efecto anestésico se inducirá en 1 - 2 min. Revise el reflejo de pellizco de los dedos del pie para asegurar una profundidad suficiente de la anestesia antes de la operación.
- Afeitar la piel del flanco dorsal y aplicar crema depilatoria para disolver las proteínas de queratina en el tallo del cabello.
nota: El uso de crema depilatoria para eliminar el vello facilitará la infusión de ADN en la piel.
- Use bolas de algodón empapadas en agua para limpiar la crema depilatoria.
nota: La crema depilatoria es soluble en agua. La eliminación completa de la crema evitará una superficie grasosa y garantizará un mejor resultado de pinchado.
- Utilice un bastoncillo de algodón estéril empapado en etanol al 70% para desinfectar la superficie de la piel.
- Marque el área objetivo (1 cm x 1 cm) en la piel depilada con una plantilla previamente medida. nota: Marcar el sitio objetivo ayudará a aplicar el haz de agujas hacia arriba y hacia abajo dentro de un área definida. Esto es importante para garantizar la entrega de la misma cantidad de ADN a un área de superficie específica para minimizar la variación de un experimento a otro.
- Coloque una gota de 10 μL de ADN plasmídico (10 μg) sobre la piel marcada.
nota: La cantidad de ADN para la acuñación varía según los diferentes genes y el tipo de vector de expresión. La cantidad de ADN utilizada debe valorarse cuidadosamente antes de realizar el experimento de interés. Los 10 μL son una pequeña gota de líquido y se asientan bien sobre la piel afeitada y depilada sin rodar mientras se pincha. Incluir un grupo de control de ratones tratados con 10 μL de ADN vectorial vacío para compararlo con ratones con el gen de estudio.
- Sostenga el haz de agujas de acupuntura (Figura 1B) y pinche la superficie marcada con un movimiento hacia arriba y hacia abajo durante 100 veces o hasta que desaparezca la humedad del ADN en PBS en la piel. nota: Puede producirse cierto enrojecimiento de la superficie de la piel. Evite hacer cortes profundos que sangren.
El número de movimientos de punción hacia arriba y hacia abajo en la superficie de la piel se determina de manera operativa cuando la humedad del ADN en PBS (10 μL) desaparece en la piel. Decidimos 100 veces en 30 s porque ha dado los resultados más consistentes de los genes administrados por la acución. Si corresponde, las agujas se pueden reutilizar para hasta 6 pinchazos cutáneos objetivo (1 cm x 1 cm cada uno). Enjuague las agujas con etanol al 70% y PBS entre acufectiones. Cambie a agujas nuevas cuando estén desafiladas o por ADN plásmido diferente para evitar la contaminación cruzada.
- Coloque ratones afectados en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal hasta que estén despiertos.
- Regrese los ratones a su jaula cuando hayan recuperado la conciencia suficiente. nota: Mantenga a los ratones con acufectura en jaulas separadas (menos de 5 animales por jaula) de la jaula de los ratones sin acufectura.
- Coloque la botella de agua en su lugar y devuelva la jaula al estante IVC (jaula ventilada individualmente).
>2. Cuidados postoperatorios
- Durante las primeras 48 horas después del procedimiento, vigile de cerca a los ratones para detectar cualquier molestia, incluidos cambios de comportamiento (inquietud, agitación o trastorno alimentario) o apariencia anormal (pelaje áspero o postura encorvada).
