Ensayo in vitro para evaluar la actividad antitumoral de las células CAR-T específicas de tumores

En este artículo

Resumen

Fuente: Kueberuwa, G., et al. Un modelo de linfoma singénico de células B de ratón para la evaluación preclínica de células T con CAR CD19. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un ensayo in vitro para validar la actividad de las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Las células de linfoma de células B que expresan el antígeno CD19 y la luciferasa citoplasmática se cultivan conjuntamente con células CAR-T específicas de CD19. La unión de CAR a CD19 en un tumor induce a las células CAR-T a liberar citocinas y toxinas que causan citotoxicidad en las células tumorales. La actividad de las células CAR-T se evalúa cuantificando la citocina liberada y la disminución de la bioluminiscencia mediada por luciferasa en las células tumorales.

Protocolo

1. Validación in vitro de la actividad de las células CAR-T

Siembra células tumorales CD19+ diana singénicas con o sin expresión de luciferasa a una densidad de 1 x 10⁴ células en 100 μL de medio de células T (MTC) completo/pocillo en una placa de cultivo de tejido con fondo en U de 96 pocillos.
Agregue 1 x 10^{4 células} CAR-T CD19/pocillo en un volumen de 100 μL/pocillo para lograr una relación efector/objetivo (E:T) de 1:1.
nota: Deben establecerse relaciones E:T para cada construcción de CAR y línea celular objetivo.
Utilice los linfocitos T solos y las células tumorales solos como controles negativos y los linfocitos T estimulados por forbol-miristato-acetato (PMA) (50 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) como control positivo para la liberación de interferón-gamma (IFNγ). Cocultivo de células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 16-24 h.
Después del cocultivo, centrifugar las placas a 500 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante para un análisis adicional de IFNγ e IL-12p70 ELISA.
nota: Se puede almacenar a -80 °C.
Vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de PBS que contengan luciferina (concentración final de 1,5 mg/mL). Incubar las placas durante 10 min a 37 °C. A continuación, mida la luminiscencia de cada pozo con un luminómetro adecuado.
nota: Los tiempos de exposición deben optimizarse para las líneas celulares y la densidad. Los resultados representativos se muestran en la Figura 1a. La citotoxicidad ex vivo de los linfocitos CAR-T puede modificarse para expresar luciferina mediante cocultivo con líneas celulares que expresan antígeno diana. A medida que las células CAR-T matan a las células objetivo, se libera luciferina, por lo tanto, una reducción en la señal de luminometría se correlaciona con la muerte celular. Las células no transducidas a menudo pueden tener un efecto sobre la viabilidad de la célula diana, especialmente durante largos períodos de incubación. Mida la concentración de IFNγ e IL-12p70 murinos en el sobrenadante de acuerdo con los protocolos ELISA del fabricante. Los resultados representativos se muestran en las Figuras 1b y 1c. La activación ex vivo de las células CAR-T mediante cocultivo con líneas celulares que expresan antígeno diana puede analizarse mediante el análisis del contenido de sobrenadante mediante ELISA. La proporción de células T con CAR con respecto a las células diana y la duración del período de cocultivo deben optimizarse para cada construcción de CAR, línea celular diana y analito. El tratamiento con PMA e ionomicina se puede utilizar como control positivo para confirmar la calidad de las células T y su capacidad de respuesta.

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Resultados

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Figura 1. Validación de la actividad de las células T con CAR. Las células CAR-T αmCD19 se cocultivaron con células de linfoma A20 modificadas para expresar luciferasa (1 x 10⁴:1 x 10⁴) durante 16 h en una placa de 96 pocillos con fondo en U. Después del cocultivo, se peletizaron las células y se recolectó el sobrenadante. A) Las células se resuspendieron en PBS...