Un ensayo in vitro para evaluar la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas

Resumen

Fuente: Baik, C. H., et al. A Ensayo de citotoxicidad en placa para la evaluación de la función citolítica de las células asesinas naturales de la placenta de rata. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la realización de un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para determinar la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) contra las células cancerosas objetivo. El ensayo cuantifica la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa citoplasmática de las células cancerosas midiendo la absorbancia del producto de color rojo formado.

Protocolo

1. Ensayo de citotoxicidad: Protocolo de ensayo

1. Utilice una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de fondo redondo para configurar la placa como se sugiere en la Tabla 1. Esta tabla muestra los controles experimentales y 3 conjuntos de columnas experimentales NK. Esto se puede expandir a un total de 10 columnas experimentales NK en una placa de 96 pocillos.
2. Centrifugar la placa de ensayo a 250 x g durante 4 minutos para asegurarse de que las células efectoras y diana están en contacto. Incubar la placa de 96 pocillos durante 5 horas en una incubadora de cámara humidificada a 37 °C, 5% de CO₂ para lograr un amplio contacto entre las células objetivo y efectoras y la lisis de las células diana por las células efectoras><. nota: El protocolo se puede pausar aquí.
3. 45 minutos antes de cosechar los sobrenadantes, agregue 10 μL de solución de lisis 10x a los pocillos de liberación máxima de LDH de la celda objetivo (pocillos 1E, 1F, 1G y 1H) y vuelva a colocar la placa en la cámara humidificada.
4. Una vez finalizado el tiempo de incubación, centrifugar la placa a 250 x g durante 4 min. Con una pipeta multicanal, transfiera 50 μL de alícuotas de todos los pocillos a una placa de ensayo nueva de fondo plano de 96 pocillos.
   nota: No toque el fondo de los pocillos para que las células no se transfieran a la placa de ensayo fresca. No utilice una placa tratada cultivada como placa de ensayo fresca.

>2. Hacer reactivo de ensayo.

1. Después de que el tampón de ensayo haya alcanzado la temperatura ambiente, agregue 12 ml de tampón de ensayo a una botella de mezcla de sustrato. Invierta y agite suavemente hasta que se disuelva por completo. 1 botella es suficiente para dos placas de 96 pocillos.
   nota: El tampón de ensayo debe protegerse de la luz mientras se descongela. Mezclar inmediatamente antes de usar.
2. Añada 50 μl de reactivo de ensayo a todos los pocillos de la placa de ensayo del paso 4.6. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   nota: El reactivo de ensayo recién hecho debe almacenarse en un congelador. El reactivo es bueno durante aproximadamente 8 semanas.
3. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Lea la placa dentro de 1 hora después de agregar la solución de parada y registre la absorbancia a 490 nm.
   Los datos representativos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1: Disposición de la placa de ensayo. TCS = Liberación espontánea de LDH en la célula diana (50 μL de células diana + 50 μL de medio de célula diana); TCM = Liberación máxima de LDH en la célula diana (50 μl de células diana + 50 μl de medio de célula diana); VCC = Control de corrección de volumen (50 μL de medio de célula objetivo + 50 μL de medio de célula NK); CMB = control de fondo del medio de cultivo (50 μL de medio de célula diana + 50 μL de medio de célula NK); ECSR = Liberación espontánea de células efectoras (50 μL de células NK + 50 μL de medio de células NK); EW = Pozos experimentales (50 μL de células diana + 50 μL de células NK).

1	número arábigo	3	4	5
Tcs	VCC	ECSR-1	RESOLUCIÓN CENTRAL DIGITAL 2	RED-3
Tcs	VCC	ECSR-1	RESOLUCIÓN CENTRAL DIGITAL 2	RED-3
Tcs	VCC	ECSR-1	RESOLUCIÓN CENTRAL DIGITAL 2	RED-3
Tcs	VCC	ECSR-1	RESOLUCIÓN CENTRAL DIGITAL 2	RED-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

Tabla 2: Datos brutos de absorbancia de una placa de ensayo que contiene los controles experimentales en las columnas 1 y 2 y pozos experimentales para medir la citotoxicidad de las células NK placentarias de ratas NP y RUPP frente a las células diana YAC1.

1	número arábigo	3	4	5
		Np	RUPP	Np
0,615	0,484	0.473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0.61	0,486	0,464	0.459	0,469
0,605	0.55	0,524	0.526	0.543
0.576	0,504	0.519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0.526	0,508	0.519

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	CELLTREAT	229190	estéril, fondo redondo
Raspador de células	pescador	8100241
Cytotox 96 Kit de ensayo de citotoxicidad no radiactiva	Promega	G1780
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medio
Célula YAC-1	ATCC	TIB-160