>1. Síntesis de triacrilato de policaprolactona (PCLTA)
- Secar 3,2 mL de triol de policaprolactona (PCL) de 400 Da durante la noche a 50 °C en un matraz abierto de fondo redondo de 200 mL y carbonato de potasio (K2CO3) en un vial de vidrio a 90 °C.
- Mezcle el triol con 6,4 mL de diclorometano (DCM) y 4,246 g de K2CO3 bajo argón.
- Mezclar 2,72 mL de cloruro de acriloilo en 27,2 mL de DCM y añadir gota a gota a la mezcla de reacción en el matraz durante 5 min.
- Cubra la mezcla de reacción con papel de aluminio y déjela sin tocar a temperatura ambiente durante 24 h bajo argón.
- Después de 24 h, filtre la mezcla de reacción con un papel de filtro en un embudo Buchner al vacío para descartar el exceso de reactivos.
- Precipitar el filtrado del paso 1.5 que contiene el polímero con tapa final en éter dietílico en una escala 1:3 (vol/vol) y rotavap a 30 °C para eliminar el éter dietílico.
>2. Formación de la poliburbuja
NOTA: Inyectar polímero en el agua desionizada (DI) haría que las burbujas de polietileno migraran al fondo del vial, lo que resultaría en un fondo aplanado. En su lugar, utilice un 10% (peso por vol) de carboximetilcelulosa (CMC) para llenar el vial de vidrio y evitar el aplanamiento de las poliburbujas.
- Prepare una solución de CMC al 10% (peso por volumen) en agua desionizada.
- Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 0,8 ml de CMC al 10 % utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
- Mezclar 1000 mg/mL de PCL de 14 kDa en DCM y sintetizar PCLTA en una escala 1:3 (vol/vol) para un volumen total de 200 μL o preparar 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa de diacrilato de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGADA) en cloroformo.
- Mezcle la 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona (fotoiniciador) con la mezcla de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) en 0,005:1 (vol/vol).
- Cargue 200 μL de mezcla de polímero en una jeringa de vidrio de 1 mL montada en una bomba de jeringa que está conectada a un tubo dispensador de acero inoxidable con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
- Use un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el CMC al 10% en el vial de vidrio para formar la burbuja de polietileno.
- Cura las poliburbujas bajo ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 254 nm durante 60 s a 2 W/cm2.
- Congele rápidamente las burbujas de polietileno en nitrógeno líquido y liofilice durante la noche a 0,010 mBar al vacío y a -85 °C.
- Separe las burbujas de polietileno de la CMC seca con pinzas y lave las burbujas de polietileno con agua desionizada para eliminar cualquier residuo de CMC. Tenga en cuenta que se pueden usar otros polímeros, probablemente con modificaciones para alterar la cinética de liberación.
>3. Modulación del diámetro de la poliburbuja
- Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con CMC al 10 % utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
- Mezclar PCL/PCLTA en una proporción 1:3 (vol/vol) con 1000 mg/mL de PCL de 14kDa y sintetizar PCLTA. Mezcle el fotoiniciador con una mezcla de polímeros en un 0,005:1 (vol/vol).
- Cargue la mezcla de polímero en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que está conectada a un tubo dispensador de acero inoxidable con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
- Use un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el CMC al 10% en el vial de vidrio para formar la burbuja de polietileno.
- Para obtener burbujas de polietileno con varios diámetros, varíe la velocidad de dosificación de 0,0005 a 1 μL/s.
- Tome imágenes del frasco con las burbujas de polietileno con diferentes diámetros.
- Utilice ImageJ para cuantificar el diámetro de las burbujas de polietileno y utilice el tamaño del vial como escala.
>4. Centrar la carga dentro de la burbuja de polietileno
- Modulación de la viscosidad PCL/PCLTA utilizando K2CO3:
nota: La viscosidad de PLGADA no tiene que modificarse utilizando K2CO3 porque la viscosidad de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL es suficiente para centrar la carga.
- Agregue K2CO3 (que se aisló después de la reacción de PCLTA) a la PCLTA en concentraciones variables que incluyen 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL y 60 mg/mL.
- Mida las viscosidades dinámicas de las soluciones cambiando la velocidad de cizallamiento de 0 a 1000 1/s utilizando reometría.
- Inyecte manualmente la carga en el medio (consulte el paso 4.2 para preparar la mezcla de carga) de las burbujas de polietileno que se formaron utilizando las soluciones de PCL/PCLTA con diferentes concentraciones de K2CO3 (paso 4.1.1). Determine la concentración óptima de K2CO3 observando qué solución del paso 4.1.1 puede resultar en la retención de la carga en el medio.
- Centrado de la carga (ya demostrado factibilidad con moléculas pequeñas) con CMC
- Mezcle la carga con CMC al 5% (peso / vol) en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga.
- Inyecte manualmente 2 μL de mezcla de carga en la burbuja de polietileno y proceda con el curado UV a una longitud de onda de 254 nm durante 60 s a 2 W/cm2.
- Congele rápidamente las burbujas de polietileno en nitrógeno líquido durante 30 s y liofilice durante la noche a 0,010 mBar al vacío y a -85 °C.
- Separe las burbujas de polietileno de la CMC seca con pinzas y lávelas con agua desionizada para eliminar cualquier residuo de CMC.
- Corte la burbuja de polietileno por la mitad y obtenga una imagen de las mitades utilizando microscopía confocal para asegurarse de que la carga esté centrada (consulte el paso 6 para conocer las longitudes de onda de excitación y emisión utilizadas).
5. Formulación de carga
NOTA: La formulación de Polybubble puede albergar varios tipos de carga, incluidas moléculas pequeñas, proteínas y ácidos nucleicos.
- Con base en estudios previos, en el caso de la carga de proteínas, use excipientes que incluyen polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP) y glicopolímeros para mejorar la estabilidad de la proteína durante la formulación de poliburbujas.
- Forme burbujas de polietileno basadas en el protocolo del paso 2.
- Prepare la solución de antígeno añadiendo 17,11 g de trehalosa a 625 μL de antígeno gp120/41 del VIH.
- Inyecte manualmente 1 μL de solución de antígeno en el centro de la poliburbuja.
- Abra poliburbujas en los días 0, 7, 14 y 21, y registre la fluorescencia del antígeno con longitudes de onda de excitación y emisión de 497 nm y 520 nm, respectivamente.
- Determine la funcionalidad del antígeno mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y utilice leche descremada al 5% como tampón de bloqueo.
>6. Liberación de la carga
>NOTA: Se puede utilizar una molécula pequeña o antígeno como tipo de carga
- Molécula pequeña
- Incubar poliburbujas con acriflavina centrada en 400 μL de solución salina tampón de fosfato (PBS) a 37 °C, 50 °C para las poliburbujas PLGADA y a 37 °C, 50 °C, 70 °C para las poliburbujas PCL/PCLTA.
nota: La razón por la que recomendamos realizar pruebas por encima de las temperaturas corporales es a) simular la temperatura (50 °C) a la que alcanza la poliburbuja mientras se inyectan con láser las nanovarillas de oro (AuNR) dentro de PCL y PLGA; y b) acelerar el proceso de degradación del PCL (50 °C, 70 °C).
- En cada punto de tiempo, recoja los sobrenadantes y reemplácelos con 400 μL de PBS fresco.
- Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recolectados.
nota: Utilice ex/em de 416 nm/514 nm para la acriflavina.
- antígeno
- Incubar poliburbujas con suero de albúmina bovina centrado (BSA)-488 en 400 μL de PBS a 37 °C, 50 °C para poliburbujas PLGADA y a 37 °C, 50 °C para poliburbujas PCL/PCLTA.
- En cada punto de tiempo, recoja los sobrenadantes y reemplácelos con 400 μL de PBS fresco.
- Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recolectados. Utilice ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
nota: No se debe realizar un estudio de liberación a 70 °C para poliburbujas de PCL/PCLTA para evitar exponer el antígeno a temperaturas extremas.