Un ensayo para evaluar los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus

Resumen

Fuente: Lee, J., et al. Evaluación de la muerte celular utilizando un sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos tridimensionales de esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un ensayo in vitro para estudiar los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS). Al exponer a los esferoides del cáncer colorrectal a dosis variables de LCFS, la interacción con los metabolitos bacterianos en el LCFS induce la apoptosis en las células cancerosas, alterando la estructura del esferoide y provocando la muerte celular de una manera dependiente de la dosis.

Protocolo

>1. Cultivos de células bacterianas y preparación de sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS)

NOTA: Los pasos 1.2 a 1.9 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.

1. Prepare una placa de agar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) y un caldo que contenga L-cisteína y esterilicelo en autoclave.
2. Preincubar la placa de agar MRS en una cámara anaeróbica_H2 mantenida a 37 °C con 20 ppm de oxígeno.
3. Descongele el stock bacteriano de Lactobacillus e inocule la placa de agar con el cultivo bacteriano (Figura 1A (i)).
4. Incubar las bacterias durante 2 - 3 días en una cámara anaeróbica_H2 a 37 °C y 20 ppm de oxígeno hasta obtener colonias bacterianas individuales.
5. Lave y seque el tubo de cultivo anaerobio tipo Hungate. Autoclave el tubo de cultivo a 121 °C durante 15 min.
6. A continuación, incubar el tubo en una cámara anaeróbica_H2 a 37 °C y 20 ppm de oxígeno para eliminar el oxígeno.
7. Coloque de 2 a 3 ml de caldo MRS en el tubo. Selle el tubo con un tapón de caucho butílico y enrosque la tapa.
8. Obtenga una sola colonia con un asa y colóquela en el tubo de cultivo de 1,5 mL con 500 μL de PBS 1x. (Figura 1A (ii)).
9. Suspenda la colonia con una jeringa de 1 mL (Figura 1A (iii)). Para ello, inserte la aguja de la jeringa de 1 ml en el centro de la tapa del tubo, aspire la colonia suspendida y luego vuelva a suspenderla en el medio de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
10. Incubar el medio de caldo MRS en una incubadora agitadora durante 2 días (37 °C, 5% CO₂, 200 rpm).
11. Mida la densidad óptica (OD) utilizando un espectrofotómetro para monitorear las curvas de crecimiento bacteriano hasta que la absorbancia a OD₆₂₀ alcance 2.0.
12. Separe los gránulos bacterianos y los medios acondicionados centrifugando a 1.000 x g durante 15 min. Lave los gránulos bacterianos recolectados con 1x PBS y vuelva a suspender en 4 mL de RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. No incluya ningún antibiótico en el medio.
13. Mantener los gránulos bacterianos en RPMI e incubar en una incubadora agitadora durante 4 h a 37 °C con 5% de CO₂ a una velocidad de 100 rpm.
14. Para la preparación del sobrenadante probiótico, retire el pellet bacteriano mediante centrifugación a 1000 x g, durante 15 min a 4 °C. Filtre estérilmente el sobrenadante recuperado con un filtro de 0,22 μm y almacene a -80 °C hasta su uso.

>2. Generación de esferoides

1. Preparación de líneas celulares de cáncer colorrectal
   1. Cultivar líneas celulares DLD-1, HT-29 y WiDr como monocapas hasta un 70-80% de confluencia e incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO₂ (Medio de crecimiento: RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina).
   2. Para las células cultivadas en una placa de Petri de 100 mm, lave la placa dos veces con 4 ml de 1x PBS. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar la placa de Petri durante 2 min a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% para disociar las células.
   3. Después de la incubación, verifique la disociación celular bajo un microscopio y neutralice la tripsina-EDTA con 5 mL de medio de crecimiento.
   4. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue durante 3 min a 300 x g.
   5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente con 3 mL de medio de crecimiento.
   6. Cuente las células con azul de tripán para determinar las células viables utilizando un hemocitómetro. (Figura 1B (i))
2. Formación de esferoides
   1. En un tubo cónico de 15 mL, diluir las células de 2.1.5 para obtener 1 - 2 x 10⁵ células/mL (Figura 1B (ii))
   2. Añadir una concentración final de metilcelulosa al 0,6% a la suspensión celular y transferir las células diluidas a un depósito estéril.
      NOTA: Para cada línea celular, la cantidad de metilcelulosa necesaria debe valorarse y determinarse en consecuencia.
   3. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 μL de células en cada pocillo de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultrabaja. (Figura 1B iii))
   4. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO₂ durante 24 - 36 h.
   5. Después de 24 a 36 h, observe la placa bajo un microscopio óptico para asegurar la formación de esferoides.

>3. Tratamiento de células de cáncer colorrectal en 3D con LCFS

1. Genere esferoides como se describe en los pasos 2 y 3.
2. Antes de realizar el tratamiento con LCFS, descongele el LCFS congelado a temperatura ambiente (RT) durante 10 a 20 min.
3. Inocular la solución madre de LCFS en un medio de crecimiento. Diluido en serie al 25 %, 12,5 % y 6 % en el medio de crecimiento (es decir, 25 % de LCFS = 150 μL de medio de crecimiento + 50 μL de LCFS).
4. Extraiga la placa de cultivo celular que contiene esferoides de la incubadora y extraiga la mayor cantidad posible de medio de crecimiento de cada pocillo con una pipeta de 200 μL.
5. Añadir el sustrato con LCFS en las células e incubar a 37 °C en una incubadora con 5% de_CO2 durante 24 - 48 h.
   nota: El volumen a utilizar dependerá del tamaño de la placa de la siguiente manera: 2 mL para placas de cultivo celular de 6 pocillos; 200 μL para placas de cultivo celular de 96 pocillos.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática de la formación de esferoides y la preparación de LCFS.

(A) Las imágenes de representación esquemática del protocolo de generación LCFS están marcadas por (i-iv) (B) Los esquemas de la formación de esferoide mediada por metilcelulosa están marcados por (i-iii).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Película adhesiva óptica MicroAmp de Applied Biosystems	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 cubiertas
Tubo de microcentrífuga Axygen MaxyClear Snaplock de 2.0 mL, polipropileno, transparente, no estéril, 500 tubos/paquete, 10 paquetes/caja	Corning	SCT-200-C	500 tubos/paquete, 10 paquetes/caja
BD Difco Bacto Agar	Bd	214010	500 g
Caldo BD Difco Lactobacilos MRS	Bd	DF0881-17-5	500 g
Solución salina tamponada con fosfato de Corning, 1X sin calcio ni magnesio, PH 7,4 ± 0,1	Corning	21-040-CV	500 mL
Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo Falcon de 5 mL, con tapón a presión de filtro de celdas	Corning	352235	25/paquete, 500/caja
Suero fetal bovino, certificado, origen estadounidense	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
Lactobacillus fermentum	Colección Coreana para Culturas Tipo	KCTC 3112
Clorhidrato de L-cisteína monohidrato	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Metilcelulosa (3500-5600mPa·s, 2% en agua a 20°C)	TCI	M0185	500 g
Placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos con código de barras, 0,1 ml	Biosistemas Aplicados	4346906	20 platos
Unidad de filtro de jeringa Millex-GS, 0,22 μm, mezcla de ésteres de celulosa, 33 mm, óxido de etileno esterilizado	Millipore	SLGS033SB	250
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Materiales/Equipos/Software
Incubadora deCO2	Termo pescador	HERAcell 150i
Tubo cónico 15 ml	Spl	50015
Tubo cónico 50 ml	Spl	50050
Placa de pocillos múltiples de fijación ultrabaja Corning Costar	Sigma-Aldrich	CLS7007
Placa de pocillos múltiples de fijación ultrabaja Corning Costar	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar Depósitos de reactivos de 50 mL, 5/bolsa, estériles	Coprotagonista	4870
Portaobjetos de la cámara de conteo de células Countess	Termopescador	C10228
Countess II FL Contador de células automatizado	invitrogen	AMQAF1000
Lector multimodo EnSpire	Perkin Elmer		Inspiración 2300
Pipeta multicanal Eppendorf Research Plus, 8 canales	Eppendorf	3122000051
Agitador incubado	Compañero de laboratorio	SIF-6000R
Calibre múltiple versión 3.0,	Fujifilm		Tokio, Japón
Densidad óptica (OD)Espectrofotómetros Lambda UV/Vis	Perkin Elmer		Waltham, MA, Estados Unidos
Microscopio de contraste de fases	Olimpo		Tokio, Japón
Tubo de microcentrífuga SPL de 1,5 ml	Spl	60015
Reservorios multicanal SPL, 12 canales, PS, estériles	Spl	Año 21012
Procesadores de líquidos ultrasónicos Vibra-Cell	Célula vibratoria SONICS	VC 505	Procesador ultrasónico de 500 vatios
Cámara anaeróbica de vinilo	PRODUCTOS DE COY LAB