Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

Abstract

Fuente: Dagur, R. S. et al., Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH.J. Vis. Exp.(2019)

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Procesamiento de la sangre del cordón umbilical y el aislamiento de células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas (HSPC)

1. Realice todos los pasos del protocolo en condiciones estériles en cabinas de flujo laminar.
2. Tome sangre de cordón umbilical (CB) recolectada en tubos heparinizados y aumente el volumen hasta 35 mL agregando solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque la muestra sobre el medio de separación de linfocitos (LSM) como se ilustra en la Figura 1 y centrifugue el LSM con el CB estratificado a 400 x g durante 35 min a 4 °C sin frenos.
   nota: Diluya la sangre con cuidado y suavidad para evitar que se mezcle en la interfaz.
3. Retire la capa superior de LSM y plasma con cuidado y transfiera la interfaz de la capa leucitaria blanca a un nuevo tubo con una pipeta de transferencia.
4. Vuelva a suspender la capa leucocitaria en 30 - 40 mL de tampón helado (PBS + 0,5% de albúmina sérica bovina [BSA] + 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]). Con una pipeta, combine 20 μL de la suspensión celular con 20 μL de azul de tripán al 0,4% y pipetee 10 μL de la mezcla en la abertura exterior de cualquiera de las dos cámaras de un portaobjetos de conteo e inserte el portaobjetos en un contador de células automatizado para contar las células.
   nota: Use un tampón helado en todos los pasos, ya que ayuda a mantener las células viables.
5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante con cuidado. A continuación, añade 300 μL de tampón helado.
6. Añadir 100 μL de reactivo bloqueante del receptor Fc humano y 100 μL de microperlas conjugadas con anticuerpos monoclonales anti-CD34 humanos en ratón para un máximo de 1 x 10⁸ células (véase la Tabla de Materiales). Incubar durante 30 min a 4 °C, añadir 10 mL de tampón helado para lavar las células y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: Escale esto de acuerdo con el número de celda si hay más de 1 x 10⁸ celdas presentes.
7. Retire con cuidado el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 μL de tampón y proceda con el paso de separación magnética para enriquecer las HSPC.
8. Coloque una columna LS de selección positiva (consulte la Tabla de materiales) en el campo de clasificación de celdas activadas magnéticamente y pásela con 3 mL de tampón.
9. Cargue la muestra en la columna LS que puede atrapar microperlas unidas a CD34+ humano en las muestras y permitir que fluya bajo la influencia de la gravedad hacia el tubo de recolección.
10. Lave la columna 3 veces con tampón y recoja el eluto en el mismo tubo de recolección de la fracción CD34^- de las células.
11. Sumerja la columna con 5 mL de tampón para eluir las células CD34⁺ en un nuevo tubo de recolección. Repita el procedimiento para lograr una pureza del >90%.
12. Cuente las células CD34⁺ eluidas con un tinte azul de tripán en un hemocitómetro. Después de contar, centrifugar las células CD34⁺ a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
13. Resuspender las células CD34⁺ en 25 μL de PBS para una inyección que se utilizará inmediatamente en el trasplante o criopreservar las células a una concentración de 1-2 millones/mL en medio de congelación (medio del Roswell Park Memorial Institute [medio RPMI 1640] + 50% de suero fetal bovino (FBS) + 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para su uso posterior en el trasplante.
    nota: Siempre haga un recuento de las células viables antes de usarlas en el trasplante.
14. Para comprobar la pureza del eluido CD34⁺, tomar 50 μL de la suspensión e incubarla con 10 μL de ficoeritrina o anticuerpo CD34 humano conjugado con PE durante 30 min a 4 °C. Después de la incubación de anticuerpos, lavar las células teñidas con PBS, resuspenderlas en 100 μL de PBS y, a continuación, proceder a realizar la citometría de flujo. Agregue un tubo adicional de células sin anticuerpos para diseñar la puerta en el citómetro de flujo.
15. Después de la adquisición, analice los datos seleccionando la región de interés en un gráfico de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC), seguido de la compuerta para celdas individuales en gráficos de área FSC y altura FSC. Puerta de células CD34 positivas en células individuales en el canal PE y el gráfico de área SSC.

>2. Preparación de hepatocitos humanos (HEP) para trasplante

1. Retire los hepatocitos criopreservados del nitrógeno líquido, sumerja rápidamente el vial en el baño de agua y descongele durante aproximadamente 90 a 120 s.
2. Retire el tapón del vial y vierta los hepatocitos descongelados en el tubo cónico de 50 ml del medio de descongelación calentado.
3. Suspenda las células balanceando el tubo de 50 mL con la mano durante unos segundos.
   nota: No haga vórtice en el tubo.
4. Granular las celdas a 100 x g durante 8 min a temperatura ambiente. Lave las células peletizadas en PBS con 0,1% de BSA y acompúllelas con HSPC frescas o descongeladas (proporción 10:1) en PBS en un volumen final de 80 μL/ratón.

>3. Manejo de animales, cribado, genotipado y tratamiento para el trasplante de HSPC y hepatocitos humanos

1. Manejo de animales
   1. Como resultado de una inmunodeficiencia grave, cría, aloja y manipula ratones TK-NOG en condiciones asépticas.
   2. Siempre use una bata de laboratorio, guantes, cubrezapatos y una mascarilla para prevenir la infección con microorganismos potencialmente patógenos.
   3. Use guantes e instrumentos estériles para la cirugía y manipule a los animales de manera aséptica durante toda la cirugía.
2. Selección de ratones TK-NOG para el experimento
   1. Mantener la colonia de cepas TK-NOG mediante la cría de ratones TK-NOG hembras con compañeros de camada machos no TK-NOG y seleccionar descendencia transgénica mediante genotipado.
      nota: Realizar el genotipado (ver paso 3.3) para determinar la presencia o ausencia del transgén en ratones machos y hembras recién nacidos en el momento del destete.
   2. Seleccione machos a las 6 a 8 semanas de edad para el trasplante debido a su alta sensibilidad a la depleción mediada por GCV de los hepatocitos que expresan el transgén HSV-TK.
   3. Marcaje las orejas de los ratones en el momento del destete o la cirugía para facilitar su identificación. Anote el peso y el estado de salud de los animales.
3. Genotipado de la presencia del transgén HSV-TK mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
   1. Realizar el genotipado en el momento del destete (generalmente a las 3-4 semanas de edad). Para el genotipado, corte un trozo de la oreja del ratón en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar para mantener la esterilidad y extraer el ADN genómico mediante el uso de un kit de aislamiento de ADN genómico.
   2. Amplificar el ADN genómico extraído del auricular en una mezcla de reacción de 20 μL para detectar el transgén HSV-TK bajo control del promotor de albúmina humana mediante la adición de 1 μL de cebador directo 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL de cebador inverso 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL de sonda FAM 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', y 10 μL de mezcla maestra en un instrumento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
   3. Ajuste los ajustes de PCR en tiempo real de la siguiente manera: 60 °C durante 30 s (etapa de prelectura), 95 °C durante 10 min (etapa de retención), 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min (etapa de PCR) y 60 °C durante 30 s (etapa de poslectura).
      nota: Un ciclo de umbral (Ct) por debajo de 22 se considera positivo para el transgén HSV-TK.
4. Tratamiento con ganciclovir y treosulfán
   1. Con una aguja de 27 G, inyecte a los ratones TK-NOG inyecciones intraperitoneales de GCV (6 mg/kg) 2 veces al día el día 7 y el día 5 en 100 μL de solución salina antes de la cirugía para agotar las células parenquimatosas transgénicas de los ratones (como se muestra en la estrategia experimental de la Figura 2).
   2. En los días 3, 2 y 1 antes de la cirugía, se preacondicionó a los ratones con dosis intraperitoneales no mielosupresoras de treosulfán (1,5 g/kg/día) en 100 μL de solución salina, utilizando una aguja de 27 G.
   3. Un día antes de la cirugía, extraiga de dos a tres gotas (~100 μL) de sangre de la vena submandibular pinchándola con una lanceta de 5 mm y aísle el suero por centrifugación (1.500 x g durante 10 min a 4 °C) para el ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) para evaluar el grado de daño hepático.
5. Preparación para la cirugía
   1. Use tijeras para afeitar el pelaje del ratón que rodea el sitio de la incisión (a la izquierda de la pared peritoneal) antes de la cirugía.
   2. Ajuste el flujo de oxígeno a 1 L/min y el flujo de isoflurano a 3% - 5% en una cámara de inducción utilizando una máquina de anestesia de ratón. Coloque un ratón a la vez en la cámara de inducción para la anestesia.
   3. Conecte un extremo de un tubo de extensión estéril (con una capacidad de retención de 550 μL de suspensión; consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones) a una aguja de 30 G y el otro extremo a una jeringa de 1 mL.
   4. Llene la jeringa con la suspensión (80 μL/ratón) de HEP y HSPC agrupados (consulte la sección 2), coloque la jeringa en la muesca de una pipeta dispensadora repetitiva y ajuste el dispensador para dispensar 10 μL en cada prensa.
   5. Una vez que los ratones están anestesiados (generalmente después de 3 a 4 minutos), cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz y reduzca la tasa de flujo de isoflurano a 2% - 3%.
6. Trasplante intraesplénico de HSPCs y hepatocitos humanos en ratones
   1. Realice todos los pasos de la cirugía en una cabina de flujo laminar en condiciones estériles.
   2. Coloque un paño limpio y estéril sobre la superficie de trabajo y frote el lado izquierdo del cuerpo de cada ratón con povidona yodada al 10 % seguido de alcohol isopropílico al 70 %, antes de realizar una incisión.
   3. Haga una pequeña incisión (~1 - 1,5 cm de largo y 5 mm de profundidad) en la piel, el músculo y el peritoneo a la izquierda de la pared peritoneal con unas tijeras tipo Vanna para entrar en la cavidad peritoneal aproximadamente 5 mm por debajo del borde inferior de la caja torácica.
   4. Ubique el bazo, tire de él ligeramente con pinzas hasta el área de operación para facilitar el acceso e inserte la aguja de 30 G en el polo inferior del bazo.
   5. Desbloquee el émbolo de la pipeta dispensadora y dispense 10 μL de volumen a la vez, con un límite de 60-80 μL por bazo. Retraiga la aguja lentamente y corte el bazo con pinzas de ligadura utilizando un aplicador de ligadura.
   6. Empuje el bazo hacia adentro de la cavidad corporal con aplicadores con punta de algodón humedecidos con PBS estéril.
   7. Cierre la capa muscular de la pared abdominal utilizando un patrón de sutura interrumpido absorbible (no continuo). Logre el cierre de la piel con un patrón de sutura interrumpido utilizando suturas no absorbibles.

Results

Figura 1: Esquema del enriquecimiento de células CD34⁺ a partir de sangre de cordón umbilical.(A) La sangre del cordón umbilical se coloca en capas en el medio de separación de linfocitos (LSM) y se centrifuga para aislar la capa leucocitaria. (B) Las columnas LS se colocan en un soporte magnético y se enjuagan con un tampón BSA, seguido de la adición de u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agujas de 27G1/2"	BD biociencias	305109
Agujas de 30G1/2"	BD biociencias	305106
Tubo de poliestireno de 5 mL de fondo redondo estilo 12 x 75 mm	Corning	352054
BD 1 mL Jeringa de Tuberculina Sin Aguja	BD biociencias	309659
Bioanalizador de matrices BD FACS	BD Biociencias		Para la comprobación de la pureza de las células CD34+ eluidas
Software de matriz BD FACS	BD Biociencias		Software para el análisis de la célula CD34+ adquirida en la matriz FACS
Solución de lisis BD FACS	BD Biociencias	349202	Para lisar los glóbulos rojos
BD LSR II	BD Biociencias		Instrumento para la adquisición de muestras de citometría de flujo
BD Vacutainer Tubo de Extracción de Sangre de Plástico	BD biociencias	BD 367874	Para recolectar sangre del cordón umbilical
Albúmina sérica bovina	Sigma-aldrich	A9576
CD34 MicroBead Kit, humano	Miltenyi Biotec	130-046-702	Para el aislamiento de CD34+ HSPC
CD34-PE humano	Miltenyi Biotec	130-081-002	Anticuerpo utilizado para la comprobación de la pureza de las células CD34+ eluidas
Portaobjetos de recuento de células	Bio-rad	1450015
Kit de mini pañuelos ChargeSwitch gDNA	Thermofisher científico	CS11204	Para la extracción de ADN genómico del auricular
Aplicadores con punta de algodón	Mckesson	24-106-2S
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
Juego de extensión Microbore Corredera(s) deslizante(s) Cerradura Luer macho fija. L: 60 pulgadas L: 152 cm PV: 0.55 mL Trayectoria del fluido Estéril	BD biociencias	30914	Acoplado a la pipa dispensadora y para cargar con HSPC y suspensión HEP
FACS Diva versión 6	BD Biociencias		Se requiere software de citómetro de flujo para la adquisición de la muestra
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	10438026
Software de análisis FLOWJO v10.2	FLOWJO, LLC		Software de análisis de citometría de flujo
Ganciclovir	APP Productos farmacéuticos, Inc.	315110	Droga de prescripción
Tubos Greiner MiniCollect EDTA	Greiner bio-one	450475
Medio de descongelación de hepatocitos	Laboratorios de investigación Triangle	MCHT50
Aplicadores de clips de ligadura abierta Horizon	Teleflex	537061	Para sujetar las pinzas de ligadura
Hepatocito humano	Laboratorios de investigación Triangle	HUCP1	Hepatocitos humanos criopreservados, calificados para inducción
Tijeras de iris, rectas	Ted Pella, Inc.	Año 13295
lanceta	MEDIpoint	Vara de oro 5 mm
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Se utiliza para atrapar microperlas CD34+ (selección positiva)
Medio de separación de linfocitos (LSM)	MP Biomedicals	50494	Para el aislamiento de linfocitos de sangre periférica
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	Contiene el separador Qudro MACS y las columnas LS
Tijeras de resorte de microdisección McPherson-Vannas	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.	RS-5605	Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo
Pinzas de microdisección	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.	RS-5157	Para sostener y extraer el bazo de la cavidad peritoneal
Ratón CD45-FITC	BD Biociencias	553080	Específico del ratón
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Hyclone	SH30256.02
Separador MACS de Qudro	Miltenyi Biotec	130-090-976	tiene capacidad para cuatro columnas LS
RPMI 1640 medio	Gibco	11875093
PCR en tiempo real de StepOne Plus	Biosistemas Aplicados		Instrumento utilizado para el genotipado
Pipeta dispensadora repetitiva de la serie Stepper de 1 ml	DYMAX CORP	T15469	Se utiliza para dispensar HSPC y HEP de forma controlada
Mezcla maestra de expresión génica TaqMan	Thermofisher científico	4369016
Contador de células automatizado TC20	Bio-rad	1450102
Ratones TK-NOG			Proporcionado por el Instituto Central de Animales de Experimentación (CIEA, Japón; Dres. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
Treosulfán	Medac GmbH		Proporcionado por el Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)
Azul de tripano	Bio-rad	1450022
Micro Tijeras tipo Vannas, recta, 80mm L	Ted Pella, Inc.	Año 1346	Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo
Pinzas de ligadura de titanio tradicionales Weck hemoclip	Esuturas	523700	Para ligar el bazo después de la inyección