Una técnica para la generación de células CAR-T específicas de antígenos

Resumen

Fuente: Davidson, H. W., et al. Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas primarias de ratón específicas de antígeno para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra una técnica para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno a través de la transducción retroviral. Los linfocitos T CD8+ murinos activados se añaden a una placa de micropocillos recubierta con fragmentos de fibronectina recombinante. A continuación, se introducen vectores retrovirales que contienen ARN transgénico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico del antígeno, y se centrifuga la placa para facilitar la transducción. Después de la incubación, las células transducidas expresan CAR específicos de antígeno en su superficie.

Protocolo

1. Generación y validación de anticuerpos Fab de cadena simple (scFab)-CARs.

>NOTA: Los CAR suelen contener 3 dominios críticos: un dominio de orientación al antígeno, un dominio espaciador/transmembrana y un dominio de señalización citoplasmática. El diseño preciso de cada CAR depende del objetivo previsto, por lo que, aparte de las características clave del constructo relevante para la generación del retrovirus, no se describirán en detalle en este protocolo. En la Figura 1 se muestra el diseño general de los CAR utilizados para los estudios que se describen a continuación. En resumen, el dominio objetivo comprende toda la cadena ligera y el dominio variable y CH1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal principal unido por un enlazador semirrígido. El dominio espaciador/transmembrana es de CD28 de ratón, y el dominio de señalización es una fusión que contiene elementos de CD28, CD137 (4-1BB) y CD247 (CD3ζ) de ratón. Estos elementos se ensamblan mediante procedimientos estándar de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de superposición de empalme, o la síntesis de un "bloque de genes" apropiado. Los detalles de la generación del mAB287 CAR se encuentran en Zhang et al. Las secuencias de ADNc pueden obtenerse de los autores previa solicitud.

1. Montaje de la construcción CAR
   1. Sintetice el anticuerpo Fab de cadena simple dirigido (scFab) y los dominios combinados de espaciador/señalización por separado, y utilice una técnica de ligadura de "3 puntos" para ensamblar la construcción final (Figura 1).
      NOTA: El requisito clave para el inserto CAR es que debe contener sitios endonucleasa de restricción flanqueantes que permitan la ligadura en el vector de expresión retroviral pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), o un derivado relacionado.
2. Validación de la expresión de la superficie CAR
   1. Transducir las células de hibridomas utilizando partículas retrovirales derivadas de pMIG II generadas por un protocolo estándar (p. ej., Holst et al.).
   2. Ejecute un análisis de citometría de flujo para detectar la expresión de GFP desde el vector CAR.
   3. Expresión de la superficie de tinción del CAR de los hibridomas transducidos utilizando anticuerpos marcados contra la cadena κ del ratón (por ejemplo, clon RMK-45).
3. Validación de la especificidad del CAR
   1. Estimula las células de hibridomas transducidos con antígenos celulares o unidos a placa apropiados. Después del cocultivo durante la noche, recoja los sobrenadantes y las citocinas secretadas, y se ensaye mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
      NOTA: Lo ideal es que cada CAR se valide de forma independiente antes de utilizarlo para la transducción. En este paso, el experimento puede detenerse y reiniciarse más tarde.

>2. Transfección de células productoras de virus (día - 4 a día 3)

NOTA: El retrovirus se produce utilizando células Phoenix-ECO (ver la Tabla de Materiales). Use las precauciones adecuadas para la generación de agentes potencialmente infecciosos (preferiblemente incluyendo un gabinete designado de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) y una incubadora separada para el cultivo de células transfectadas/transducidas).

1. Descongelación de células Fénix (Día -4)
   1. Descongele 2 x 10⁶ celdas Phoenix-Eco. Aumente el número de células Phoenix si se planean varias transducciones.
   2. Colocarlos en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm con 10 mL de medio (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene un 10% de suero fetal de ternero (FCS)).
2. Pasaje Celdas Fénix (Día -3)
   1. Retire el medio y lave con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
   2. Añadir 3 mL de tripsina al 0,25% e incubar a 37 °C bajo una atmósfera de 10% de_CO2 durante 3 min.
   3. Cosechar las células y luego pellets por centrifugación durante 3 min a 200 x g. Vuelva a colocar las células con 10 ml de medio fresco e incubar a 37 °C.
3. Irradiación de células Fénix (Día -1 tarde)
   1. Para minimizar la división celular, recoja las células Phoenix como se describe en el paso 2.2, vuelva a suspender en 5 mL de medio e irradie las células con rayos gamma en hielo (1000 rad).
      NOTA: Se debe tener precaución durante el trabajo con radiación para evitar la exposición del personal.
   2. Centrifugar las células irradiadas, volver a suspender en medio fresco, colocar la placa en 2 x 10⁶ células (en 10 mL de medio)/placa/CAR e incubar.
4. Transfección (Día 0 - mañana)
   1. Aspire el sobrenadante de las células Phoenix, lave con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y agregue cuidadosamente 7 mL de medio sérico reducido (por ejemplo, Opti-MEM) gota a gota en la pared lateral de la placa para evitar alterar la monocapa. Transfiera las células de regreso a la incubadora.
   2. Tome dos tubos de polipropileno de fondo redondo de 14 mL y agregue 1,5 mL de medio sérico reducido a cada uno. A un tubo, agregue 40 μL de reactivo de transfección (consulte la Tabla de materiales).
   3. Al otro tubo, agregue 15 μg de plásmido Ab-CAR (generado en el paso 1) y 5 μg de plásmido de envoltura y empaque (5 μg de pCL-Eco). Incuba los tubos a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Añada la mezcla de reactivos de transfección del paso 2.4.2 gota a gota al segundo tubo sin entrar en contacto con los lados del tubo, y mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 min.
   5. Agregue 3 mL de la mezcla gota a gota a las células Phoenix y colóquelas en una incubadora de cultivo de tejidos.
   6. Después de 4-5 h, agregue 1 mL de FCS. Cultivar las células durante la noche a 37 °C.
5. Cambio medio (Día 1)
   1. Retire el sobrenadante que contiene los complejos de reactivos de plásmido/transfección y deséchelos de acuerdo con los procedimientos institucionales para el manejo de material infeccioso. Agregue 4 mL de medio de cultivo fresco y precalentado a las células.
6. Virus de cosecha para la transducción (Día 2)
   1. Recoja el medio que contiene el virus de las células Phoenix con una jeringa estéril, filtre (0,45 μm) para eliminar los restos de células residuales y recoja en un tubo nuevo.
   2. Añadir caldo recombinante de interleucina-2 humana (rhIL-2) hasta una concentración final de 200 unidades internacionales (UI)/mL. Utilice el virus inmediatamente para la transducción (paso 5.3). Agregue 4 ml de medio fresco a las células Phoenix y colóquelas en la incubadora.
7. Recolección repetida de virus (Día 3)
   1. Repita el paso 2.6, pero deseche las células Phoenix como desechos infecciosos en lugar de agregar medio fresco. Este sobrenadante se utiliza en el paso 5.4.

3. Aislamiento y activación de linfocitos T CD8 primarios (día -1 a día 0)

NOTA: Anteriormente, recoja células T CD8 de ratones diabéticos no obesos (NOD) hembras a las 4-5 semanas, un punto de tiempo antes de que comience la inflamación de los islotes. Manejar todos los ratones siguiendo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Las células T CD8 se enriquecen a partir de esplenocitos utilizando un kit comercial de selección de negativos.

1. Placas de recubrimiento con anticuerpos CD3/CD28 (Día -1)
   1. Añada 1 mL de una mezcla de anticuerpos anti-ratón CD3 y CD28 (ambos a 1 μg/mL en PBS) a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, e incube a 4 °C durante la noche.
   2. Al día siguiente, lavar las placas con 1 mL de PBS estéril 3 veces antes de añadir los linfocitos T CD8 murinos (paso 4.1).
      NOTA: El número de pocillos a recubrir variará para cada experimento, dependiendo del número total de células T CD8 activadas requeridas.
2. Recogida de esplenocitos (Día 0)
   1. Eutanasia a dos ratones hembra NOD de 4 a 5 semanas de edad utilizando la inhalación de CO₂ seguida de la decapitación. Recoja los bazos y colóquelos en un colador de células empapado en 10 mL de PBS en una placa de cultivo celular sobre el hielo.
   2. En una campana de cultivo celular, corte cada bazo en 3-5 pedazos, presione los tejidos con un émbolo estéril de una jeringa de 3 o 5 ml para forzar la separación de los fragmentos de bazo y permitir que las células pasen a través de la malla de alambre.
   3. Extraiga suavemente los glóbulos rojos resuspendiendo los esplenocitos en tampón de lisis de glóbulos rojos diluido 1:4 (1 ml de tampón de lisis en 3 mL de PBS para un bazo) e incubando durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. A continuación, diluir 10 μL de la suspensión celular con una solución de colorante azul de tripán para el recuento de células con un hemocitómetro y granular el resto de las células por centrifugación a 350 x g durante 7 min.
3. Enriquecimiento de linfocitos T CD8 (Día 0)
   1. Enriquezca las células T CD8 mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células T CD8 de ratón, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Para garantizar una alta pureza, siempre redondee el número de células al calcular el volumen de anticuerpos biotinilados que se agregarán (por ejemplo, use el volumen de reactivos sugerido para 10⁸ celdas para un cálculo de 9.1 x 10⁷ celdas).
   2. Suspender los gránulos celulares en 400 μL de tampón y 100 μL de cóctel biotina-anticuerpo por 1 x 10⁸ células, mezclar bien e incubar durante 5 min en el refrigerador (4 °C) para permitir la unión de anticuerpos.
   3. Añadir 300 μL de tampón de etiquetado y 200 μL de microperlas anti-biotina por 1 x 10⁸ células, mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 °C.
   4. Mientras espera la unión de las microcuentas, coloque la columna de separación en el separador. Lavar la columna enjuagando con 3 mL de tampón de etiquetado.
   5. Pase 1000 μL de mezcla de cordón/célula a través de un filtro de células de 40 μm antes de cargarlo en la columna de separación para eliminar los agregados de células. Recoja el flujo de la columna en un tubo preenfriado de 15 ml.
   6. Lave la columna según las instrucciones del fabricante, recogiendo todo el efluente en el mismo tubo. Determine el número de celdas (igual que en el paso 3.2.4) y recoja por centrifugación a 350 x g durante 5 min. Lave las células resuspendiéndolas en 2 mL de medio de células T completo (RPMI-1640 que contiene FCS, 2-mercaptoetanol, rhIL-2 (200 U/mL), interleucina-7 de ratón (mIL-7, 0,5 ng/mL), ITS, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y penicilina-estreptomicina) y centrifugando a 350 x g durante 5 min.
   7. Vuelva a suspender las células en un medio de células T completo precalentado (37 °C) a una concentración de 0,25–0,5 x 10⁶/mL.

>4. Activación de células T (Día 0 a 2)

1. Agregue 2 mL de la suspensión celular (0.25–0.5 x 10⁶/mL) a cada pocillo recubierto de la placa de 24 pocillos recubierta con anticuerpos CD3/CD28 del paso 3.1.2. Utilice un movimiento giratorio para dispensar las celdas de manera uniforme.
   NOTA: Agregue las celdas con un movimiento giratorio para distribuirlas uniformemente y minimizar los efectos de los bordes. Si las células se agrupan a lo largo del borde de los pozos, tanto la tasa de transducción como la viabilidad de la célula disminuirán.
2. Como control, coloque la misma cantidad de células T CD8 en un solo pocillo de la placa sin recubrimiento. Incubar las celdas a 37 °C utilizando una incubadora gaseada con 10% de_CO2 durante 48 h.
   NOTA: Después de 48 h, la activación se puede confirmar con un microscopio; las células activadas serán más grandes que las células que no encontraron anticuerpos anti-CD3/CD28.

>5. Transducción de linfocitos T CD8 activados (días 1 a 3)

NOTA: Este protocolo utiliza un método de transducción de espín. Se requiere una centrífuga con un rotor abatible y adaptadores de placa de cultivo de tejidos que sea capaz de mantener una temperatura interna de 37 °C. Para garantizar la máxima eficiencia, el día de la transducción se precalienta la centrífuga a 37 °C antes de recoger el virus.

1. Preparación de placas recubiertas con fragmentos de fibronectina humana (día 1 a día 2)
   1. El día 1, agregue 0,5 mL de fibronectina (50 μg/mL en PBS) a los pocillos de una placa de 24 pocillos, e incube durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Por lo general, se requieren dos pocillos recubiertos de fibronectina por placa de células Phoenix transfectadas.
   2. El día 2, retire la solución de fibronectina y reemplácela con 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para "bloquear" los sitios de unión no específicos.
   3. Lave los pocillos tratados con 1 mL de PBS estéril. Después de quitar la solución de lavado, la placa está lista para usar; o bien, se puede sellar y almacenar a 4 °C hasta por una semana.
2. Recolección de linfocitos T CD8 activados (Día 2)
   1. Recoja las células T CD8 activadas, cuente y calcule la viabilidad de las células utilizando azul de tripán o un instrumento automatizado adecuado.
   2. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender a 5 x 10⁶ células viables/mL para la transducción. Mantener una pequeña alícuota de células en cultivo en el medio completo de células T en la incubadora de CO₂ para proporcionar un control para la posterior clasificación de células activadas por fluorescencia de las células transducidas (paso 6).
      NOTA: Después de la activación durante 48 h, el número total de células debería haber aumentado aproximadamente 1,5 veces y tener una viabilidad superior al 95%.
3. Transducción (Día 2)
   1. Añada 100 μL de suspensión de células CD8 activadas por pocillo (0,5 x 10⁶ células) a la placa recubierta de fibronectina. A continuación, añada de 1,5 a 2 ml de medio que contenga virus (a partir del paso 2.6) a cada pocillo. Mezcle con un movimiento giratorio para dispensar las celdas de manera uniforme (Figura 2).
   2. Coloque la placa en una bolsa de plástico con cierre hermético y séllela (para proporcionar una contención secundaria). Centrífuga a 2000 x g durante 90 min a 37 °C.
   3. Retire la placa de la centrífuga. En la seguridad biológica, el gabinete retire con cuidado la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con ningún medio.
   4. A continuación, transfiera la placa a la incubadora de_CO2 específica a 37 °C. Después de 4 h, retire 1 mL del medio de cada pocillo y reemplácelo con 1 mL de medio de células T completas precalentado. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de_CO2.
      NOTA: Manipule todos los medios de las células transducidas como residuos infecciosos.

Resultados

Figura 1: Esquema de la construcción retroviral del CAR. El CAR comprende un dominio de diana derivado del fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal de ratón adecuado, y un dominio espaciador/anclaje de membrana/señalización de ratón CD28, CD137 y CD247. El ADNc sintético se inserta en el vector de expresión retroviral pMIG-II. Se muestran los sitios endonucleasa de restricción utilizados para genera...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol (50mM)	Gibco	21985-023	50 uM
5' CARRERA PCR	Clontech	634859
anticuerpos anti-ratón CD28	eBiociencia	14-0281-86	Concentración final a 1 μg/ml
anticuerpo CD3e de ratón	eBiociencia	145-2C11	Concentración final a 1 μg/ml
Biotina Rata Anti-Ratón IFN-γ	BD Biociencias	554410	Concentración de trabajo de 0,5 μg/ml
Bsa	sigma	A7030
Kit Maxi-Prep sin endodosis	Qiagen	12362
gentamicina	Gibco	15750-060	Final 50 μg/ml.
FCS inactivado por calor	Hyclone	SH30087.03	10% final FCS
HEPES (100X)	Gibco	15630-080	1X
Insulina-Transferrina-Selenio-Etanolamina (ITS 100x)	ThermoFisher	51500056	La concentración final es 1x
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668019
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Búfer de separación MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Kit de aislamiento de células T CD8a+ para ratón	Miletenyi Biotec Inc	Teléfono 130-104-075
Kit de aislamiento de células T CD8a+ para ratón	Miltenyi Biotec	Teléfono 130-104-075
Medio Opti-MEM	ThermoFisher	31985070
Penicilina-Estreptomicina (5000U/ml)	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Células Phoenix-ECO	ATCC	CRL-3214
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
pMIG II	Addgene	52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	52107
Tampón de lisis de glóbulos rojos	sigma	R7767
RetroNectin	Takara	T100A	Concentración de trabajo a 50 μg/ml en PBS
rhIL-2 (concentración de existencias 105 UI/ul)	Peprotech	200-02	Concentración final a 200 UI/ml
rmIL-7 (concentración de stock 50ng/ul)	I+d	407-ML-005	Concentración final a 0,5 ng/ml
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Filtros de células estériles	Fisher Científico	22-363-548
Tryple	Gibco	12605-028