1. Microinyección de embriones de pez cebra con cóctel de bacterias y fagos
NOTA: Para realizar una infección sistémica, el embrión debe tener circulación sanguínea que generalmente comienza después de 26 hpf.
- Después de 26 hpf, los embriones de decorionado con solución de pronasa se prepararon disolviendo el polvo de pronasa en medio E3 a una concentración de 2 mg/mL. Pipetear suavemente los embriones para romper el corion. Deseche el medio pronasa/E3 y enjuague el plato varias veces con E3 fresco para eliminar toda la pronasa.
- Anestesiar los embriones de pez cebra en medio E3 que contenga tricaína aproximadamente 5 minutos antes de las inyecciones.
- Pipetear los embriones anestesiados en la pista preparada en el paso 1. Utilice una punta de carga de gel fina para revestir los embriones en posición lateral.
- Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 μL del preparado de P. aeruginosa.
- Inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de inicio del conducto de Cuvier donde comienza a extenderse sobre el saco vitelino. Inyecte un volumen de 1-3 nL y asegúrese de que el volumen se expanda directamente dentro del conducto y entre en la circulación.
- Aproximadamente después de cada 50 embriones inyectados, inyecte una gota de la bacteria en un tubo de centrífuga de 1,5 ml con 100 μl de PBS estéril para comprobar si el volumen de inyección sigue siendo el mismo. Coloque el inóculo en agar LB (ver Tabla 1) a 37 °C durante la noche para evaluar la UFC.
- Transferir los embriones microinyectados en dos placas de Petri limpias con medio E3 fresco + PTU (Tabla 1) e incubarlos a 28 °C.
- En dos puntos de tiempo seleccionados: 30 min o 3 h después de la inyección bacteriana, saque una de las placas de Petri con embriones inyectados por bacterias de la incubadora y alinéelas en la pista como se describe en 6.3 para la inyección de cóctel de fagos.
- Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 μL del cóctel de fagos (mezcla de cuatro fagos que infectan la cepa PAO1) con una punta de carga de gel fina y fíjela al microinyector.
- Inyectar el cóctel de fagos en el conducto de Cuvier de los embriones previamente inyectados con bacterias.
- Transfiera los embriones microinyectados en dos placas de Petri limpias con medio E3 fresco + PTU e incube a 28 °C.
Tabla 1: Preparación de soluciones
| Soluciones | preparación |
| Solución madre anestésica 25X | 4 mg/mL de Tricaína en H2O destilado. |
| solución de trabajo anestésico 1X | diluir en H2O destilado la solución madre de tricaína 25X preparación para alcanzar la concentración 1X (0,16 mg/mL) de Tricaína de H2O destilado. |
| CsCl d=1.3 | 20.49 g en 50 mL TN |
| CsCl d=1.4 | 20.28 g en 50 mL TN |
| CsCl d=1.5 | 34.13 g en 50 mL TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 g en 50 mL de TN |
| Medio embrionario E3 para embrión de pez cebra | 1 L 1of E3 (diluir el caldo 50X con H2O destilado) + 200 μl de azul de metilo al 0,05%. Tienda en RT. |
| Solución madre mediana para embriones E3 (50X) | 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 y 9,95 g de MgSO4 en 5 L de H2O destilado. Tienda en RT. |
| Agar LB | 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de agar |
| LB de caldo | para 1L: 950 mL de H2O, 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura |
| PBST (en inglés) | PBS 1X + Tritón X 1% |
| Solución fisiológica | 0.9% NaCl |
| Solución madre bloqueadora de pigmentación 10X | 0,3 mg/mL de fenil tiourea (PTU) en polvo en medio embrionario E3 para embrión de pez cebra |
| Solución madre Pronase 5X | 5 mg/mL de pronasa en polvo en medio embrionario E3 para embrión de pez cebra |
| Tampón TN | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
