Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de los animales
- Utilice 132 ratas macho Sprague-Dawley de 2 meses de edad con un peso de 320-450 g (120 ratas para experimentación y 12 ratas para muestreo de sangre, Figura 1). Quince ratas para cada grupo fueron suficientes para una potencia de 0,8 (80% de posibilidades de encontrar significación estadística si existe el efecto especificado).
- Aloje a todas las ratas en jaulas clásicas en condiciones de aislamiento en una instalación convencional equipada con una estación de cambio. Instigar la cría en un estante IVC (jaula ventilada individualmente), con ratas SPF (libres de patógenos específicos) que se compran específicamente.
- Utilice las siguientes condiciones de la carcasa: rango de temperatura de 19-24 °C; humedad relativa: 40-60%; ventilación: frecuencia de renovación del aire: 10-15 por hora; ciclo de luz/oscuridad: 12 h-12 h.
- Esterilice todo el equipo de jaula y use ropa de cama irradiada. Implemente sistemáticamente el enriquecimiento de las jaulas colocando bandejas de cartón estériles y toallas dentro de las jaulas.
- Permitir el acceso a la zona en condiciones restringidas: bata de laboratorio nueva, mascarilla, guantes, calzado y gorro de pelo en la entrada.
- Realizar anualmente el seguimiento sanitario de las colonias de animales centinela alojados en lechos sucios, de acuerdo con las recomendaciones de Felasa para las instalaciones convencionales. Mantener de cuatro a cinco animales por jaula con la dieta irradiada adecuada y proporcionar agua acidificada ad libitum. Monitoree diariamente.
- Traslado de las ratas elegidas para la intervención quirúrgica en jaulas superiores filtrantes a las salas quirúrgicas 2 h antes de la cirugía.
>2. Procedimiento quirúrgico
- Prepare el instrumental quirúrgico: tijeras finas, una pinza, dos pinzas hemostáticas y un portaagujas. Durante todos los procedimientos, use guantes, una mascarilla, una capucha y una bata de laboratorio.
- Divida aleatoriamente las ratas en dos grupos (PRP y solución salina).
- Saca a la rata de su jaula y pésala. Use marcas auriculares numeradas para identificar a las ratas. Para evitar la desecación de los ojos, coloque gotas de agua en la córnea.
- Anestesiar a la rata por vía intraperitoneal con xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (80 mg/kg de peso corporal). Someter a los animales a vigilancia cardiorrespiratoria para confirmar la anestesia y comprobar los reflejos oculares.
- Inyectar 50 μL de buprenorfina por vía subcutánea (0,01-0,05 mg/kg cada 8-12 h) en la zona del cuello como analgésico.
- Afeitar la extremidad trasera izquierda con una afeitadora eléctrica, desinfectarla con 3 exfoliantes alternos de solución de iso-betadina/alcohol (diluida 1:10) y colocar la rata sobre una almohadilla tibia (20 °C) bajo un microscopio de disección. Coloque la rata en decúbito lateral con la pata a operar en una posición superior. Sostenga la pata con pinzas quirúrgicas.
- Con las tijeras, haga una pequeña incisión lateral (20-25 mm) en la piel que rodea el tendón de Aquiles izquierdo y diseccione la fascia con unas tijeras finas para exponer el complejo del tendón de Aquiles (Figura 2a).
- Retire el tendón plantar con unas tijeras (Figura 2b).
- Cortar transversalmente el tendón de Aquiles 5 mm proximal a su inserción calcánea y extraer una porción de 5 mm de largo con unas tijeras. No suturar el tendón (Figura 2c, 2d).
- Suturar la fascia y la piel con hilo reabsorbible, haciendo una sutura por overjet (sutura continua). Las suturas de monofilamento también pueden evitar la absorción de la piel hacia la incisión quirúrgica.
- Coloque a la rata bajo una lámpara de calefacción hasta que se despierte, y luego vuelva a colocar la rata en una jaula (58 x 38 cm) (Nota bene: No se impone ninguna inmovilización).
>3. Preparación PRP
- Anestesiar a las ratas donantes con xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (80 mg/kg de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal. La inyección de PRP se lleva a cabo 2 h después de la operación sin ningún tipo de reanestesia.
- Inyectar 50 μL de buprenorfina por vía subcutánea como analgésico.
- Recolectar sangre entera (20 mL por rata, sangrado final) por punción cardíaca en tubos estériles que contengan citrato de sodio tamponado al 3,2% (0,109 M, anticoagulante). Luego, eutanasiar a la rata mediante inyección intracardíaca.
- Para obtener PRP, centrifugar la sangre durante 10 min a 150 x g y temperatura ambiente. Este paso inicial de centrifugación a baja velocidad produce dos fases distintas: una fase inferior formada por glóbulos rojos (RBC) que representa aproximadamente el 80-90% del volumen total y una fase superior compuesta por plasma rico en plaquetas (PRP) (normalmente el 10-20% de la muestra de sangre).
- Recoja el PRP (fase superior) en un tubo de plástico secundario utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Dado que la interfaz entre el PRP y los glóbulos rojos es muy laxa, no pipetee demasiado cerca de la interfaz. Cuando se manipulan correctamente, los glóbulos rojos contaminantes en PRP deben estar por debajo de 0,05 x 103 células/μL. Deseche la fase inferior restante y el tubo de extracción de sangre primario.
- Determine el volumen de PRP recogido y mida el recuento de plaquetas en un analizador de hematología. Estos valores son necesarios para los cálculos para ajustar la concentración de plaquetas en el siguiente paso. Un recuento de células sanguíneas también es útil para evaluar la posible contaminación con glóbulos rojos y leucocitos. La concentración de plaquetas en PRP en esta etapa suele ser de 1 a 1,5 x106/μL.
- Realizar una segunda centrifugación del PRP durante 10 min a 1.000 x g y temperatura ambiente. Este paso de centrifugación de alta velocidad produce una peleta de plaquetas sueltas y un sobrenadante de plasma autólogo pobre en plaquetas (PPP). Utilizando los valores determinados en el paso 3.6, calcular el volumen de sobrenadante a desechar para concentrar el PRP y alcanzar una concentración final de 2,5 x106/μL.
- Recoja suavemente el sobrenadante (PPP) en un tubo de plástico secundario utilizando una pipeta de transferencia de plástico, dejando aproximadamente dos tercios del volumen final calculado en el paso 3.7. Como el pellet está suelto, se pierde una cantidad significativa de plaquetas cuando se desecha el PPP, lo que puede reducir la concentración deseada.
- Vuelva a suspender con cuidado el pellet de plaquetas con el sobrenadante restante mediante un pipeteo suave y repetido. Mida el recuento de plaquetas en este PRP concentrado. Si es necesario, agregue el volumen apropiado de PPP autólogo para alcanzar la concentración objetivo final.
nota: Utilice el PRP dentro de las 3 h posteriores a la preparación.
- Añadir 50 μL de CaCl2 (11 mEq 10 mL) por mL de PRP para activar las plaquetas.
- Inyecte 50 μL de PRP fresco o solución salina con una aguja de 21G directamente en el lugar de la operación suturada aproximadamente 1 h después de la preparación. Durante este tiempo, mantenga el PRP a temperatura ambiente.
- Vigile de cerca la recuperación funcional de las ratas durante los días posteriores a la cirugía y antes de la extirpación del tendón de Aquiles.
