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>1. Síntesis de polímeros poli(beta amino ésteres) (pBAE) con oligopéptidos finales (OM-pBAE)
- Polimerización de C6-pBAE
- Agregue 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) en un matraz de vidrio de fondo redondo (100 mL). A continuación, añadir diacrilato de 1,4-butanodiol (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Precalentar el baño de aceite de silicona a 90 °C, colocar el matraz de fondo redondo en el baño de aceite y agitar la mezcla con la ayuda de una barra de agitación magnética durante toda la noche (~18 h). A continuación, saque el producto del matraz de fondo redondo y colóquelo en el congelador a -20 °C.
nota: El producto se presenta en forma de polvo pegajoso y se extrae del matraz con la ayuda de una espátula. Es imprescindible validar la estructura del polímero obtenido a través de 1H-RMN. Los espectros de RMN se registraron en un instrumento de 400 MHz (ver Tabla de Materiales) utilizando cloroformo-d yD2O como solventes. Se tomaron alrededor de 10 mg de cada éster de poli(β-amino) y se disolvieron en 1 ml del disolvente deuterado.
- Reacción con péptidos para la obtención de OM-pBAE
- Añada 25 mL de HCl 0,1 M a los péptidos seleccionados, por ejemplo, el péptido Cys-His-His-His con ácido trifluoroacético (TFA, 200 mg), en un tubo de centrífuga de 50 mL previamente pesado que pueda soportar la liofilización y agitar manualmente durante la noche para obtener una solución clara.
- Congelar la solución a -80 °C durante 1 h y liofilizar el clorhidrato peptídico resultante.
NOTA: Compruebe si el peso final corresponde al valor teórico.
- Prepara una solución de C6-pBAE (0,031 mmol) en dimetilsulfóxido. Además, haga una solución del péptido clorhidrato (0,078 mmol) en dimetilsulfóxido.
- Mezcle las dos soluciones en un tubo con tapón de rosca y enrosque el tapón. Agitar la solución de la mezcla en un baño de agua a una temperatura controlada de 25 °C durante 20 h con una barra agitadora magnética.
- Agregue la mezcla a éter dietílico/acetona 7:3 (v/v). Centrifugar la suspensión resultante a 25.000 x g a 4 °C para eliminar el disolvente. A continuación, lave el sólido con éter dietílico/acetona 7:3 (v/v) dos veces. A continuación, seque el producto al vacío (<0,2 atm).
- Prepare una solución de 100 mg/mL del producto en dimetilsulfóxido. El producto resultante se denomina péptido C6-pBAE. Es imprescindible validar la estructura del polímero obtenido a través de 1H-RMN para confirmar la desaparición de las señales de olefinas asociadas a los acrilatos terminales. Si no se utiliza, el polímero se puede congelar a -20 °C.
>2. Formación de poliplexos
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse dentro de una habitación acondicionada para mantener una temperatura constante.
- Descongele los polímeros C6-péptido-pBAE y agite la solución.
- Pipetear la mezcla de polímeros hacia arriba y hacia abajo y preparar una solución de 12,5 mM (V1) en acetato de sodio (NaAc). Luego, agita la mezcla y espera 10 min.
- Preparar el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) a 0,5 mg/mL y mezclar por pipeteo (V2).
nota: Es crucial evitar el vórtice del ARNm.
- Agite la mezcla de polímeros en la concentración final para lograr una solución homogénea entre el stock de polímero en dimetilsulfóxido (DMSO) y el tampón de acetato.
nota: La concentración final del polímero depende de la relación N/P (grupos nitrógeno a fosfato) seleccionada. La relación N/P depende de cada ARNm específico que se vaya a utilizar. Para la encapsulación mejorada de proteínas verdes fluorescentes (eGFP), por ejemplo, se utilizó una proporción de 25:1, como se informó anteriormente.
- Mezcle la solución de material genético y la solución de C6-peptidepBAE (25 veces la concentración de ARNm) en una proporción de 1:1 (Vi = V1 + V2).
nota: El péptido-pBAE C6 se carga en un tubo de microcentrífuga donde se agrega el ARNm pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclarlo. Una vez preparado, las concentraciones de poliplex, ácido nucleico y péptido-C6-pBAE se diluyen a la mitad.
- Incubar a 25 °C durante 30 min en un bloque térmico. Precipite con agua libre de RNasa 1:2 añadiendo la muestra a un tubo de microcentrífuga precargado con agua.
- Incluye los excipientes. Añadir el mismo volumen que la mezcla de ARNm y pBAE (Vi) en ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) 20 mM y sacarosa al 4% pipeteando hacia arriba y hacia abajo. En este punto, la muestra se ha diluido 3 veces.
>3. Liofilización de poliplexos
- Congelar instantáneamente a -80 °C en el congelador la solución de poliplexo anterior durante 1 h.
- Realice el secado primario siguiendo los pasos: (1) 1 h a -60 °C y 0,001 hPa; (2) 1 h a -40 °C y 0,0001 hPa; (3) 4 h a -20 °C y 0,0001 hPa; (4) 12 h a 5 °C y 0,0001 hPa.
- Almacenar a -20 °C inmediatamente para evitar la rehidratación hasta su uso.