1. Expresión del núcleo de nanopartículas de proteínas autoensamblables que contiene un haz de seis hélices (SHB-SAPN) Proteína en E. coli BL21(DE3)
- Mezcle 95 mL del componente A y 5 mL del componente B del medio en un matraz Erlenmeyer de vidrio estéril de 2 L según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Añadir ampicilina hasta una concentración final de 100 μg/mL.
- Inocular el medio con E. coli a partir de un cultivo de glicerol previamente establecido. Incubar el cultivo a 30 °C con agitación a 200 rotaciones por minuto (rpm) durante 48 h.
NOTA: El stock usado de E. coli BL21 (DE3) contenía el vector de expresión resistente a la ampicilina con el gen SHB-SAPN. Aunque el protocolo general de los medios recomienda 24 h de incubación a 37 °C, 48 h de incubación a 30 °C dan un mayor rendimiento para SHB-SAPN.
- Transfiera el cultivo a dos tubos cónicos de 50 mL. Centrifugar los tubos a 4.000 x g durante 10 min con un rotor de ángulo fijo a 4 °C. Retirar el sobrenadante y guardar el pellet para recolectar células.
NOTA: El pellet de celda puede procesarse inmediatamente o congelarse a -80 °C hasta su uso.
>2. Lisis de E. coli BL21(DE3) por sonicación
NOTA: Utilice artículos de plástico y cristalería no pirogénicos horneados a 250 °C durante al menos 30 min. La tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), como agente reductor, rompe los enlaces disulfuro dentro y entre las proteínas. El TCEP es necesario para los tampones durante este protocolo si el antígeno mostrado contiene enlaces S-S. Solo para el núcleo SHB-SAPN, la presencia de TCEP en los búferes no es esencial.
- Prepare un tampón sin imidazol (8 M de urea, 50 mM de fosfato de sodio monobásico, 20 mM de Tris base, 5 mM de TCEP) pH 8,0 (ajustado con hidróxido de sodio 5 N, NaOH) y fíltrelo con una unidad de filtración en botella de vacío de 0,22 μm.
- Vuelva a suspender las células peletizadas (a partir del paso 1.3) con 40 mL de tampón sin imidazol en un tubo cónico de 50 mL. Sonicar las células resuspendidas con una sonda en hielo durante 5 min (4 s de sonicación, 6 s de reposo) con una salida de sonicación de 150 W.
- Centrifugar el lisado celular (40 mL) a 29.000 x g a 4 °C durante 25 min en un rotor de ángulo fijo para generar sobrenadante clarificado. Transfiera el sobrenadante a un matraz estéril de 150 ml y deseche el pellet. Diluir el sobrenadante a 100 mL utilizando el tampón libre de imidazol (más adelante en el protocolo denominado "muestra").
NOTA: Este paso de dilución es necesario para evitar que la presión del sistema de cromatografía líquida de rendimiento rápido (FPLC) sea demasiado alta durante la carga de lisado en la columna.
>3. Purificación de proteínas mediante una columna de His
NOTA: Este protocolo se realizó utilizando un instrumento FPLC, pero se puede adaptar al flujo de gravedad.
- Preparar los siguientes tampones y filtrarlos con una unidad de filtración en botella al vacío de 0,22 μm: (i) tampón sin imidazol "Tampón A" (8 M de urea, 50 mM de fosfato de sodio monobásico, 20 mM de Tris base, 5 mM de TCEP) pH 8,0; ii) 500 mM de tampón imidazol "Tampón B" (8 M de urea, 50 mM de fosfato sódico monobásico, 20 mM de Tris base, 5 mM de TCEP, 500 mM de imidazol) pH 8,0; y (iii) lavado con isopropanol (20 mM Tris, 60% de isopropanol) pH 8.0.
NOTA: El pH de cada tampón se ajustó con NaOH 5 N.
- Equilibrar la columna His.
NOTA: Para la producción a escala de laboratorio, este protocolo utiliza una columna His preempaquetada de 5 mL, pero se puede utilizar cualquier columna de mayor tamaño.
- Abra el software FPLC y haga clic en la opción Nuevo método. Se abrirá inmediatamente en el menú de configuración del método. En el menú desplegable para la posición de la columna, elija C1 puerto 3.
- En el menú desplegable Mostrado por técnica, elija afinidad. En el menú desplegable Tipo de columna, elija otros, Histrap HP, 5 mL. El volumen de la columna y las cajas de presión se ajustarán automáticamente a los valores adecuados.
- Haga clic en el botón Esquema del método. Arrastre los siguientes botones desde el menú emergente de la biblioteca de fases: equilibrio, aplicación de muestra, lavado de columna y elución junto a la flecha en ese orden exacto. Cierre el menú Biblioteca de fases.
- Haga clic en el botón de equilibrio. Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" (4%), "búfer final B" (4%) y "volumen (CV)" 5.
- Haga clic en el cuadro Ejemplo de aplicación. En el cuadro de carga de muestras, haga clic en el botón de opción Inyectar muestra en columna con bomba de muestra. Asegúrese de que la casilla junto a la configuración Usar caudal del método esté marcada en la caja de inyección de muestra con bomba del sistema. Junto al cuadro de volumen en el lado derecho de la pantalla, cambie el valor a 20 mL.
- Haga clic en el botón Lavado de columna. Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" (4%), "búfer final B" (4%) y "volumen (CV)" 5. Junto al esquema de recolección de fracciones, desmarque la casilla Habilitar.
- Haga clic en el botón de elución. Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" 0%, "búfer final B" 100% y "volumen (CV)" 5. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en la casilla Habilitar. Desmarque Usar tamaño de fracción en la configuración del método y ajuste el tamaño de la fracción a 4 ml en el cuadro de relleno a continuación.
- Haga clic en el botón Guardar como en la parte superior del software. Asigne al archivo el nombre "equilibrio".
- Conecte una columna His preempaquetada de 5 mL al puerto de columna 3 correspondiente en el FPLC. Tanto el tubo de la bomba A como el tubo de la bomba B, así como el tubo de la bomba de muestra, deben colocarse en agua desionizada filtrada de 0,22 μm. Ejecute el programa de equilibrio.
- Coloque la bomba A y la bomba B, así como el tubo de la bomba de muestra, en el tampón sin imidazol (tampón A) y vuelva a ejecutar el protocolo de equilibrio.
- Unir la muestra a la columna y purificar la proteína.
- Abra el software FPLC y haga clic en la opción Nuevo método. Se abrirá inmediatamente en el menú de configuración del método. En el menú desplegable de Columna, posición, elija C1, puerto 3. En el menú desplegable Mostrado por técnica, elija afinidad. En el menú desplegable Tipo de columna, elija Otros, Histrap HP, 5 mL. El volumen de la columna y las cajas de presión se ajustarán automáticamente a los valores adecuados.
- Haga clic en el botón Esquema del método. Arrastre los botones del menú emergente de la biblioteca de fases: equilibrio, aplicación de muestra, lavado en columna (Lavado 1), lavado en columna (Lavado 2), lavado en columna (Lavado 3) y Elución junto a la flecha en ese orden exacto. Cierre el menú Biblioteca de fases.
- Haga clic en el botón Equilibrio. Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" 4%, "búfer final B" 4% y "volumen (CV)" 5.
- Haga clic en el cuadro Ejemplo de aplicación. En el cuadro de carga de muestras, haga clic en el botón de opción para lamuestra I nject en la columna con la bomba de muestras. Asegúrese de que la casilla junto a la configuración Usar caudal del método esté marcada en la caja de inyección de muestra con la bomba del sistema.
- Junto al cuadro de volumen en el lado derecho de la pantalla, cambie el valor a 100 mL. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en el botón Habilitar. Desmarque Usar tamaño de fracción en el cuadro de configuración del método y, a continuación, cambie el tamaño de la fracción a 4 ml.
- Haga clic en el botón de lavado de la primera columna (Lavado 1). Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" 4%, "tampón final B" 4% y "volumen (CV)" 10. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en el cuadro Habilitar. Desmarque Usar tamaño de fracción en la configuración del método y, a continuación, cambie el tamaño de la fracción a 4 ml.
- Haga clic en el botón de lavado de la segunda columna (Lavado 2). Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" 0%, "búfer final B" 0% y "volumen (CV)" 5. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en el cuadro Habilitar. Desmarque Usar tamaño de fracción en la configuración del método y, a continuación, cambie el tamaño de la fracción a 4 ml.
- Haga clic en el botón de lavado de la tercera columna (Lavado 3). Los valores enumerados en la tabla deben ser "búfer inicial B" 0%, "búfer final B" 0% y "volumen (CV)" 5. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en Habilitar. Desmarque Usar tamaño de fracción en el cuadro de configuración del método y, a continuación, cambie el tamaño de la fracción a 4 ml.
- Haga clic en el botón Elución. En la tabla de la derecha, haga clic en la información que aparece y, en el menú que aparece, haga clic en el paso Eliminar. Arrastre el botón de degradado isocrático a la tabla dos veces para que haya dos entradas.
- El valor de la primera entrada debe ser "búfer inicial B" 30%, "búfer final B" 30% y "volumen (CV)" 10. El valor de la segunda entrada debe ser "búfer inicial B" 100%, "tampón final B" 100% y "volumen (CV)" 10. Junto al esquema de recolección de fracciones, haga clic en el botón Habilitar. Haga clic en la casilla situada junto a Usar tamaño de fracción en la configuración del método.
- Haga clic en el botón Guardar en la parte superior del software. La tubería de la bomba A del FPLC debe colocarse en el tampón de lavado sin imidazol, mientras que la tubería de la bomba B debe colocarse en el tampón de imidazol de 500 mM. El tubo de la bomba de muestra debe colocarse en la muestra de 100 ml.
- Ejecute el programa de "purificación" y espere el momento en que se necesite el 60% de isopropanol (Wash 2). Pausar el programa; Mueva el tubo de la bomba A del lavado sin imidazol al lavado con isopropanol al 60%. Reinicie el programa.
- Una vez completado el paso de isopropanol, vuelva a pausar el programa y vuelva a bombear el tubo A al tampón de lavado sin imidazol. Reinicie el programa de purificación (el resto de la ejecución está automatizada).
