Generación de vesículas de membrana plasmática a partir de células madre de médula ósea

Abstract

Fuente: Xu, L. et al., Preparación de vesículas de membrana plasmática a partir de células madre mesenquimales de médula ósea para una posible terapia de reemplazo de citoplasma.J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un método para generar vesículas de membrana plasmática a partir de células madre de médula ósea haciéndolas pasar rápidamente a través de un filtro de membrana. Estos PMV muestran potencial para la terapia de reemplazo de citoplasma.

Protocol

1. Montaje del aparato

1. Para garantizar la esterilidad, encienda la luz ultravioleta (UV) de una campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos antes de usarla.
2. Desenrosque una unidad de filtro desechable de 25 mm y sumerja la tapa y el fondo de la unidad en un vaso de vidrio de 200 ml lleno de etanol al 75% durante 30 minutos. La unidad está hecha de polipropileno de grado médico.
3. Levante la tapa y la parte inferior de la unidad con pinzas, sacuda el etanol restante con la mano y deje que las piezas se sequen al aire durante 10 minutos en el capó.
4. Humedece una membrana de policarbonato de 19 mm en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y colócala con cuidado sobre la matriz de soporte de la parte inferior de la unidad. La película de polímero tiene una superficie lisa y plana y poros de 3 μm grabados.
5. Vuelva a montar la unidad enroscando la tapa firmemente contra la parte inferior. Asegúrese de que la membrana no se desprenda del centro.
6. Retire la aguja de una jeringa de insulina de 1 mL y extraiga 1 mL de PBS. Conecte la jeringa a la unidad de filtro y luego empuje PBS a través de la unidad para humedecer el conjunto y probar si hay alguna fuga.

>2. Generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs)

1. Establecer un cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC), según lo informado por Nemeth et al., en el medio de cultivo Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco que contiene 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Cultive las células en una placa de 6 pocillos en una incubadora humidificada que contenga 5% de CO₂ a 37 °C.
2. Para propagar las células, retire el medio de cultivo y enjuague el pocillo con 0,5 mL de PBS sin calcio.
3. Añadir 0,5 mL de ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina al 0,25% (tripsina-EDTA) e incubar las células a 37 °C durante 3 min. Golpee la placa contra la palma de la mano un par de veces para facilitar el desprendimiento de las células. Detenga la digestión agregando 1 mL de medio de cultivo.
4. Recoja las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifuga a 200 x g durante 2 minutos en una centrífuga de sobremesa. Vuelva a suspender las células en 4 mL de medio de cultivo y alícuota las células en dos pocillos de una placa de 6 pocillos.
   nota: Las células suelen alcanzar la confluencia alrededor de las 24 h.
5. Para generar PMV, recoja las células de un pocillo (aproximadamente 5 x 10⁵ celdas) de una placa de 6 pocillos mediante digestión con tripsina y monodisperse las células en 0,5 mL de medio de cultivo.
6. Cargue las células en la jeringa de insulina, conéctela a la unidad de filtro y empuje el émbolo rápidamente para exprimir las células a través del filtro. Deseche el medio extruido porque solo debe haber unos pocos PMV en su interior.
7. Cargue 0,5 ml adicionales de medio en la jeringa y empújelo rápidamente a través del filtro. Se recogió el medio de la segunda extrusión, que contiene PMV de varios tamaños.
8. Cargue 150 μL del medio recolectado en un plato con fondo de vidrio de 35 mm y deje que los VMP se asienten en el fondo durante unos 10 minutos. Examine los VMP bajo un microscopio de contraste de fase invertida equipado con una cámara CCD utilizando la lente de objetivo 20X.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membranas IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	Poro de 3 mm
Unidad de filtro desechable	Xinya, Shanghái, China	25 milímetros	Polipropileno de grado médico
Jeringa de insulina	Bd	328446	1 ml