Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Mutagénesis UV para generar cepas de levadura auxotróficas
- Genere curvas de supervivencia para determinar las dosis necesarias de irradiación ultravioleta (UV)
- Prepare los medios de YPD (extracto de levadura, peptona dextrosa) y otros reactivos enumerados en la Tabla 1 de acuerdo con los procedimientos estándar e inocule colonias individuales en 5-10 ml de medios de YPD. Incubar los cultivos en un tambor de rodillos a 30 °C O/N hasta la saturación durante al menos 8 horas.
- Determine la concentración celular de los cultivos nocturnos (O/N) utilizando un espectrofotómetro diluyendo las células 1:10 en agua en una cubeta de plástico. Diluir las células hasta una concentración de 107 células/ml en 20 ml de agua destilada estéril.
- Vierta las células diluidas en una placa de Petri de plástico estéril y, sin la tapa, coloque la placa a 14 cm por debajo de una bombilla UV.
- Exponer las células a dosis seriadas de 5.000 μJ y 10.000 μJ de irradiación UV, extrayendo 500 μl de células después de cada incremento, de modo que las células se muestreen después de la exposición a 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, y 50.000 μJ de irradiación UV. Transfiera las muestras de células extraídas a tubos estériles de 1,5 ml y diluya en serie en incrementos de 1:10 en agua estéril.
- Células de pellets en cada dilución por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en un volumen de 100 μl de agua estéril apropiada para la siembra de células de levadura. Pipetee el volumen completo de células resuspendidas en placas que contengan medios sólidos de YPD y utilice un esparcidor estéril para distribuir las células de manera uniforme en cada placa.
- Envuelva los bordes de las placas en Parafilm para evitar el secado de los medios y cubra las placas en papel de aluminio para evitar la foto-reactivación y la reparación de las mutaciones inducidas por los rayos UV. Incubar las placas boca abajo a 30 °C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de colonias de levadura viables (Figura 1).
- Cuente el número de colonias, opcionalmente con la ayuda de un bolígrafo para marcar las colonias contadas, un bolígrafo electrónico de mano o un soporte de mostrador con aumento. Grafique como un porcentaje del total de células plateadas en cada dosis μJ de irradiación UV para generar una curva de supervivencia para la levadura irradiada (Figura 2).
NOTA: Se puede esperar que las cepas de levadura haploides requieran dosis más bajas de irradiación UV en relación con las cepas diploides para alcanzar el mismo porcentaje de supervivencia. Una cepa de levadura que carece de enzimas funcionales de reparación del ADN, como el mutante rad1 S. cerevisiae, puede utilizarse como control positivo para indicar la presencia de irradiación UV a dosis muy bajas.
- Determine la dosis de mutagénesis UV que se utilizará para el cribado consultando la curva de supervivencia establecida en el punto 1.1.7. El valor x del punto a lo largo de la curva de supervivencia donde y es igual a 50 es la dosis de irradiación UV a la que sobrevive el 50% de la levadura. El cribado de mutantes con este bajo porcentaje de supervivencia puede dar lugar a un mayor rendimiento de cepas mutadas con éxito, en particular para la levadura diploide. La dosis de supervivencia del 50% para WT S. boulardii, como se muestra en la Figura 2, es de aproximadamente 18.000 μJ.
NOTA: Aunque estas dosis altas de UV aumentan el riesgo de mutaciones en genes para vías celulares distintas del gen marcador auxotrófico de interés, este inconveniente debe equilibrarse con la necesidad de inducir mutaciones en ambas copias del gen marcador auxotrófico. En el caso de las cepas haploides en las que solo se debe mutar una copia del gen, el cribado con un porcentaje de supervivencia más alto, como el 90%, disminuye el riesgo de mutaciones adicionales y sigue permitiendo la generación suficiente de mutantes auxotróficos.
- Mutagénesis UV y cribado de cepas de levaduras auxotróficas
- Prepare la levadura como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.3.
- Exponga la levadura a la dosis de irradiación UV correspondiente al 50% de supervivencia, según se determina en 1.1.8. Para WT S. boulardii, se determinó que esta dosis fue de aproximadamente 18.000 μJ (Figura 2).
- Recoja volúmenes de 1 ml de levadura y gránulos irradiados con UV por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μl de agua estéril.
- Selección de mutantes
- Si se utiliza la selección, como con los mutantes auxótrofos ura3, la levadura irradiada en placas sobre un medio que contiene ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) para seleccionar las células que carecen de una enzima Ura3 funcional.
NOTA: Cualquier levadura que contenga copias funcionales de Ura3 convertirá el 5-FOA en la toxina 5-fluorouracilo, lo que provocará la muerte celular y permitirá una fácil selección de las colonias de ura3 que carecen de un Ura3 funcional. Son posibles enfoques de selección análogos para el LYS2 y el LYS5; TRP1;y marcadores MET2 y MET15 utilizando medios que contienen ácido α-aminoadípico; ácido 5-fluoroantranílico; y metilmercurio, respectivamente.
- Pipetear los 100 μl de células resuspendidas en un medio mínimo que contenga 5-FOA y utilizar un esparcidor estéril para recubrir uniformemente la placa. Envuelva las placas en Parafilm e incube boca abajo a 30 °C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de colonias de levadura viables.
- Confirme el fenotipo ura3- de cualquier colonia que aparezca en las placas de 5-FOA volviendo a trazar en las placas YPD, uracil- y 5-FOA (Figura 3). Use la punta de un palillo de dientes estéril para recolectar parte de una sola colonia y arrastre suavemente las células a través de placas frescas de YPD, uracilo y 5-FOA. De nuevo, incubar las placas envueltas boca abajo a 30 °C durante 2-4 días.
NOTA: Las colonias viables aparecerán como crecimientos elevados, aproximadamente circulares, mientras que las células no viables aparecerán solo como un frotis opaco sin ningún crecimiento elevado (Figura 3).
- Cribado de mutantes
- Si se genera un mutante auxotrófico para el que no se dispone de métodos de selección, prepare diluciones en serie 1:10 de células de levadura irradiadas con UV en agua estéril y pipetee las diluciones en medios YPD, utilizando un esparcidor estéril para recubrir uniformemente la placa.
- Envuelva las placas en Parafilm e incube boca abajo a 30 °C durante 2-4 días. Determine qué dilución permitió el crecimiento de colonias individuales que se pueden distinguir fácilmente entre sí, por lo general no más de aproximadamente 100 colonias por placa.
- Repetir la mutagénesis UV de las muestras de levadura descritas en los puntos 1.2.1-1.2.3 y de las células en placa en esta dilución determinada. Pipetear la levadura diluida en medios YPD, utilizar un esparcidor estéril para distribuir las células e incubar las placas envueltas boca abajo a 30 °C durante 2-4 días.
- Cribado de auxótrofos mediante siembra de réplicas en medios selectivos que carecen del metabolito de interés. Primero, asegure una almohadilla de terciopelo estéril en un soporte para placas e invierta la placa con colonias irradiadas con rayos UV sobre el terciopelo, marcando la orientación de la placa.
- A continuación, invierta una placa fresca que carezca del metabolito de interés sobre el terciopelo y presione ligeramente hacia abajo para transferir las células del terciopelo a la placa. Guarde la placa original a 4 °C. Envuelva e incube la nueva placa boca abajo a 30 °C durante 2-4 días.
- Como alternativa al enchapado de réplicas, se seleccionan los mutantes mediante la reasignación de las colonias de YPD a medios selectivos. Use la punta de un palillo de dientes estéril para recolectar parte de una sola colonia y arrastre suavemente las células a través de una placa fresca de YPD y una placa que carezca del metabolito de interés. Vuelva a incubar las placas envueltas boca abajo a 30 °C durante 2-4 días.
NOTA: Se debe tener cuidado de seleccionar colonias individuales y trazar colonias varias veces para confirmar una población homogénea de células auxotróficas verdaderas.
- Confirmar aún más el fenotipo de las células irradiadas mediante la inoculación de colonias individuales en 5-10 ml de YPD y medios que carecen del metabolito apropiado (por ejemplo, en uracilo-medio para un mutante ura3-). Incubar en un tambor de rodillo a 30 °C O/N para confirmar el crecimiento de las células en medios YPD, pero no en ausencia del metabolito.
NOTA: Aunque los patrones de crecimiento en medios sólidos deberían indicar claramente el estado auxótrofo de la levadura, es posible que algunas levaduras toleren el estrés y formen colonias pequeñas y de crecimiento lento en medios sólidos, pero aún así no toleren las mismas condiciones en medios líquidos (observaciones no publicadas). Por lo tanto, la inoculación en cultivos líquidos debe realizarse para confirmar minuciosamente los patrones de crecimiento de los mutantes irradiados con rayos UV.
- Para el almacenamiento a largo plazo de mutantes auxotróficos confirmados, prepare las reservas de glicerol inoculando las células en 10 ml de YPD e incubándolas en un tambor de rodillos O/N a 30 °C. Células de pellets por centrifugación durante 3 min a 2.500 x g y medios aspirados. Vuelva a suspender las células en glicerol filtrado estéril al 50%, transfiéralas a un criovial y almacene a -80 °C.
NOTA: La levadura mutagenizada UV puede contener mutaciones en múltiples genes distintos del marcador auxótrofo de interés. Antes de continuar con el uso de mutantes auxotróficos verificados, estas cepas deben analizarse más a fondo mediante la secuenciación de genes y la evaluación de la resistencia al pH, al estrés por ácidos biliares y a otras características relevantes para las cepas probióticas, como se describe en otra parte2. Además, se debe considerar el uso de la homología de PCR o la segmentación CRISPR/Cas9 para mutar marcadores auxotróficos de forma más selectiva como alternativa a la mutagénesis UV.
>2. Transformación de la levadura
- Transformación de LiOAc de levadura
- Inocular colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medio YPD e incubar en un tambor de rodillo a 30 °C O/N.
- Para inducir el crecimiento de la fase logarítmica y aumentar la eficiencia de la absorción de plásmidos, determine la concentración de células utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de células en agua estéril en una cubeta de plástico. Diluir los cultivos de O/N hasta una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,16-0,2 (aproximadamente 2 x 106- 2,5 x 106 células/ml) en 50 ml de YPD fresca y tibia e incubar las células en un agitador de plataforma orbital ajustado a 200 rpm hasta que el cultivo alcance aproximadamente 1 x 107 células/ml. Por lo general, alrededor de 4 hr.
NOTA: La eficiencia de la transformación se puede medir en función del número de unidades formadoras de colonias de levadura (UFC) transformadas con éxito por μg de ADN plasmídico. El aumento de la eficiencia da como resultado más colonias transformadas por μg de ADN plasmídico. El subcultivo de las células de levadura y la recolección durante el crecimiento de la fase logarítmica es un factor que aumenta la eficiencia de la transformación.
- Células de pellets por centrifugación a 2.500 x g durante 3 min.
- Aspire el sobrenadante y transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml resuspendiendo el pellet en 1 ml de agua estéril.
- Células de pellets por centrifugación a 16.000 x g durante 1 min en una microcentrífuga, aspirar el sobrenadante y lavar las células por resuspensión en 1 ml de tampón TE/LiOAc (Tris EDTA/acetato de litio).
- Repita la centrifugación y vuelva a suspender las células en tampón TE/LiOAc hasta una concentración de 2 x 109 células/ml.
- Prepare mezclas de transformación con cada uno de los siguientes elementos: 50 μl de levadura preparada en tampón TE/LiOAc, 5 μl de ADN portador (10 μg/μl) y 1 μl de ADN plasmídico (1 μg). Los microgramos de ADN plasmídico se pueden valorar, ya que el aumento de cantidades de ADN puede o no conducir a una mayor eficiencia de transformación.
NOTA: Para una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxotrófico, solo se puede transformar un plásmido que codifica el marcador por muestra. Además, el uso de un plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable, como la proteína verde fluorescente (GFP), permitirá la determinación eficiente del plegamiento y la expresión adecuados de la proteína heteróloga por parte de la cepa de levadura posterior a la transformación.
- A cada preparación, añadir 300 μl de PEG/LiOAc/TE y vórtice a fondo. La incubación de células intactas con polietilenglicol (PEG) es esencial para una transformación eficiente.
- Incubar las preparaciones a 30 °C durante 30 min con agitación colocando tubos de microcentrífuga en un vaso de precipitados colocado en un agitador de plataforma orbital a 200 rpm.
- Añadir 35 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada reacción y a las celdas de choque térmico durante 15 min en un baño de agua a 42 °C. Aunque hay informes contradictorios sobre el beneficio adicional del DMSO, se ha demostrado que el choque térmico de las células de levadura intactas aumenta en gran medida la eficiencia de la transformación.
- Lavar las células mediante granulación por centrifugación como en el punto 2.1.5, aspirar o pipetear el sobrenadante y resuspender en 1 ml de agua estéril. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper el pellet de la célula.
NOTA: Es fundamental eliminar completamente el sobrenadante porque los medios utilizados para generar células competentes pueden inhibir el crecimiento de levaduras y la formación de colonias.
- Repita la granulación celular como en 2.1.5, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μl de agua estéril. Pipetee todo el volumen en una placa selectiva y use un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa con levadura transformada.
- Envuelva los bordes de las placas recubiertas en Parafilm para evitar que se sequen los medios e incube boca abajo a 30 °C durante 2 días para permitir el crecimiento de las células de levadura transformadas. La transformación exitosa y eficiente y la selección auxotrófica de Saccharomyces cerevisiae producen un alto número de colonias por preparación de transformación, aunque el rendimiento puede ser mucho menor para otras cepas (Figura 4).
- Almacene las placas de levadura a corto plazo (generalmente de 1 a 3 semanas) boca abajo y tapadas a 4 °C. Prepare las existencias de glicerol de la levadura transformada como se describe en 1.2.5 para su almacenamiento a largo plazo.
NOTA: Se necesitan más estudios que analicen UFC transformadas para determinar la estabilidad del plásmido y evaluar la expresión adecuada de la proteína heteróloga. Descripciones detalladas de la estabilidad de los plásmidos, el uso de inmunotransferencia para detectar proteínas desnaturalizadas recuperadas de muestras de células, el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar proteínas tridimensionales plegadas correctamente y el uso de GFP en estudios de levadura están disponibles en otros lugares. La Figura 5 muestra una imagen representativa de la expresión exitosa de GFP en S. cerevisiae transformadaen relación con las células no transformadas. El uso de dicha proteína fluorescente es un medio para determinar de manera eficiente la producción exitosa de proteínas heterólogas.
- Electroporación de levaduras
- Inocular colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medios YPD e incubar en un tambor de rodillo a 30 °C O/N.
- Determine la concentración de células utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de células en agua estéril. Diluya los cultivos de O/N en 100 ml de medios YPD frescos y tibios hasta un equivalente deOD 600 de aproximadamente 0,3. Incubar los subcultivos a 30 °C en un agitador de plataforma orbital ajustado a 200 rpm hasta alcanzar un diámetro exterior de600 aproximadamente 1,6, normalmente 4-5 horas. Cada subcultivo de 100 ml generará suficientes células condicionadas para dos reacciones de transformación.
- Células de pellets por centrifugación a 2.500 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y lavar las células resuspendiendo en 50 ml de agua estéril helada. Repita el lavado granulando las células, aspirando el sobrenadante y volviendo a suspender en 50 ml de agua helada estéril fresca.
- Vuelva a granular las células y vuelva a suspender en 50 ml de tampón de electroporación helado (1 M de sorbitol, 1 mM de cloruro de calcio (CaCl2)).
- Repetir el centrifugado como en 2.2.3, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml de LiOAc 0,1 M/ditiotreitol (DTT) de 10 mM. Incubar la suspensión de la célula en un tambor de rodillos a 30 °C durante 30 min. La preincubación de células en LiOAc y DTT aumenta sinérgicamente la eficiencia de la electroporación.
- Granular las células como en 2.2.3, eliminar el sobrenadante y lavar resuspendiendo en 50 ml de tampón de electroporación helado. Repita la centrifugación y vuelva a suspender las células en un tampón de electroporación helado hasta un volumen final de 1 ml.
- Prepare en hielo: células de levadura acondicionadas, cubetas de electroporación estériles y ADN plasmídico. Inmediatamente después de la resuspensión final de las células condicionadas en 1 ml de tampón de electroporación, combine 400 μl de células de levadura condicionadas con aproximadamente 1 μg de ADN plasmídico y añádalas a una cubeta de electroporación helada de 0,2 μm. El uso de mayores cantidades de ADN puede aumentar ligeramente la eficiencia de la transformación. Incubar la reacción en hielo durante 5 min, luego electroporar con el electroporador ajustado a 2.5 kV y 25 μF.
NOTA: Como se describe en 2.1.7, una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxotrófico puede transformarse con un solo plásmido que codifique el marcador mutado por muestra. Además, el uso de un plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable, como la GFP, permite determinar de manera eficiente el plegamiento adecuado y la expresión de la proteína heteróloga posterior a la transformación.
- Transfiera las células electroporadas a 8 ml de una mezcla 1:1 de sorbitol YPD:1 M y deje que las células se incuben en un tambor de rodillo a 30 °C durante 60 min.
- Células de pellets como en 2.2.3 y resuspender en 100 μl 1:1 YPD:1 M de sorbitol. Coloque el volumen completo en un medio selectivo que contenga 1 M de sorbitol, envuelva los bordes de las placas en Parafilm e incube las placas boca abajo a 30 °C durante 2-5 días para permitir el crecimiento de las células de levadura transformadas.
NOTA: Es fundamental analizar la levadura transformada para evaluar la expresión adecuada de la proteína heteróloga, como se describe en 2.1.14 y 2.2.7.
- Gástago Oral de Ratones con Levadura Transformada
- Realizar todos los procedimientos de cuidado y manejo de animales de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
- Preparar cultivos de levadura O/N inoculando colonias individuales de levadura auxótropa transformada en 5-10 ml de medios selectivos. Incubar los cultivos O/N durante al menos 8 horas en un tambor de rodillos a 30 °C hasta que estén saturados.
NOTA: El uso de proteínas de prueba que codifican plásmidos, como GFP, facilitará las pruebas de expresión de proteínas en levadura gavada, como se describe en 4.7.
- Para obtener la máxima inducción de la expresión de proteínas e inducir el crecimiento de la fase logarítmica, se preparan los subcultivos a partir de los cultivos O/N diluyéndolos hasta un equivalente deDO 600 de aproximadamente 0,16-0,2 en 50 ml de medios apropiados, como se describe en el punto 2.1.2.
- Determine la concentración de células subcultivadas como en 1.1.2 y ajústela a 109 células/ml. Prepare una dosis de 100 μl para cada ratón, con unos pocos cientos de μl de volumen adicional por grupo para mejorar la precisión y la facilidad de carga de la muestra.
- Células de pellets por centrifugación a 2.500 x g durante 3 min o en una microcentrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células añadiendo un volumen igual de agua estéril y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Fije una aguja de sonda nasogástrica de calibre adecuada (22 g para ratones de 15-20 g) en una jeringa estéril de 1 ml y cargue la muestra de levadura, asegurándose de eliminar las burbujas y ajustar el émbolo a un incremento de 100 μl. Cargue una jeringa adicional con agua estéril en los ratones de control por sonda nasogástrica y verifique la presencia de levadura contaminante.
- Levante el ratón que se va a golpear con la mano no dominante, con el dedo índice y el pulgar agarrando firmemente la piel alrededor del cuello (Figura 5A). Mete la cola debajo del dedo meñique para evitar el movimiento de la parte inferior del cuerpo. Asegúrese de que el agarre esté seguro y prohíba que el ratón mueva la cabeza para evitar daños en los tejidos internos durante la sonda nasogástrica.
NOTA: Calcule hasta qué punto se debe insertar la aguja de sonda nasogástrica sosteniendo la aguja contra el ratón de manera que el bulbo quede nivelado con la apófisis xifoides del esternón. La inserción de esta longitud de la aguja generalmente permitirá que el bulbo de la aguja por sonda penetre en el estómago.
- Con la mano dominante, inserte suavemente la aguja sonda en el esófago del ratón inclinando la aguja a lo largo del paladar y la parte posterior de la garganta, manteniéndose ligeramente a la izquierda del centro. Espere a que el ratón trague el bulbo de la aguja y deje que la aguja descienda un poco más hasta el punto estimado en 3.7 (Figura 5B). Si se siente alguna resistencia durante la inserción de la aguja de sonda nasogástrica o si el ratón en algún momento comienza a jadear, retire suavemente la aguja y vuelva a intentar encontrar el esófago.
- Después de que el ratón haya tragado el bulbo de la aguja de sonda nasogástrica, presione suavemente el émbolo de la jeringa para administrar 100 μl (108 UFC) de levadura directamente en el estómago del ratón><.
NOTA: Aunque los ratones no pueden vomitar nada de la solución sonda después de la administración, es posible que se produzca reflujo durante la sonda nasogástrica. La inserción adecuada de la aguja de sonda nasogástrica, así como el ajuste del volumen y la viscosidad de la solución, pueden ayudar a limitar el reflujo y garantizar una dosificación precisa.
- Retire con cuidado la aguja de sonda nasogástrica del estómago y el esófago del ratón y devuelva el ratón a la jaula. Compruebe que el ratón respira y se mueve normalmente después de la sonda nasogástrica para asegurarse de que la aguja de la sonda se ha insertado correctamente durante todo el procedimiento y de que no se ha aspirado ninguna solución.
Tabla 1. Se describen los reactivos necesarios para la fabricación de cada una de las soluciones, los medios y placas de levadura y los tampones de transformación utilizados para los protocolos de este manuscrito.
| Soluciones | Medios y placas de levadura | Reactivos de transformación |
| Polietilenglicol (PEG) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 g de peptona | 50 ml 10x TE |
| 500 ml de agua estéril | 20 g de dextrosa | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtro esterilizado | 10 g de extracto de levadura | 400 ml de agua estéril |
| 1 L de agua | Filtro esterilizado |
| autoclave | |
| TE 10x: | Placas YPD: | PEG/TE/LiOAc: |
| Tris de 100 mM | 20 g de peptona | 400 ml 50% PEG |
| 10 mM EDTA | 20 g de dextrosa | 50 ml 10x TE |
| pH a 7,5 y esterilización por filtro | 20 g de agar | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g de extracto de levadura | |
| 1 L de agua | |
| autoclave | |
| 20% de glucosa: | Uracilo- medios selectivos | ADN PORTADOR (ADN SS): |
| 200 g de dextrosa | 2 g de mezcla de aminoácidos sin uracilo | Almacenar a -20 °C y antes de usar calentar durante 1-2 minutos a 100 °C para derretir las hebras y almacenar en hielo |
| 1 L de agua | 6,7 g de levadura base nitrogenada sin aminoácidos | |
| Filtro esterilizado | 1 L de agua | |
| Esterilización por autoclave o filtrado estéril | |
| Añadir 20% de glucosa 1:10 antes de usar | |
| 50% glicerol: | Placas de uracilo: | Tampón de electroporación: |
| 500 ml de glicerol | En un matraz de 250 ml: | 1 M de sorbitol |
| 500 ml de agua | 2 g de mezcla de aminoácidos sin uracilo | 1 mM CaCl2 |
| autoclave | 6,7 g de levadura base nitrogenada sin aminoácidos | Llenar con agua destilada |
| 150 ml de agua | Autoclave y almacenamiento a 4 °C |
| En un matraz de 2 L: | |
| 20 g de agar | |
| 750 ml de agua | |
| Matraces de autoclave por separado, luego mezclar con 100 ml de glucosa al 20% | |
| IMDM completo | Placas 5-FOA+: | LiOAc/TDT |
| 500 ml Iscove's Modificado Dulbecco's Media | Autoclave en matraz de 2 L: | 0,1 M LiOAc |
| 5 ml de penicilina estreptomicina glutamina 100x | 20 g de agar | TDT de 10 mM |
| 500 μl de 2-mercaptoetanol | 750 ml de agua | |
| Suero fetal bovino inactivado por calor al 10% | mezclar: | |
| 2,5 ml de piruvato de sodio 100 mM | 6,7 g de levadura base nitrogenada sin aminoácidos | |
| 2 g de mezcla de aminoácidos sin uracilo | |
| 150 ml de agua tibia | |
| Cuando se enfríe, agregue: | |
| 0,05 g de uracilo en polvo | |
| 1 g de 5-FOA | |
| Remover y filtrar, esterilizar | |
| Añadir a la solución de agar esterilizada en autoclave | |
| Mezclar con 100 ml de glucosa al 20% | |
