Generación de neutrófilos antiangiogénicos asociados a tumores

Resumen

Fuente: Pylaeva, E., et al. Transferencia de neutrófilos manipulados asociados a tumores a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un ensayo para generar neutrófilos asociados a tumores (TAN) antiangiogénicos. Al tomar un tumor de melanoma murino que contiene TAN proangiogénicos, las células individuales se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se tratan con un inhibidor de la nicotinamida fosforribosil transferasa (NAMPT) para reducir la capacidad de estimular la angiogénesis.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

NOTA: El esquema general del protocolo se muestra en la Figura 1.

1. Preparación de la línea celular de melanoma B16F10

1. Prepare células negativas para micoplasma cultivadas en una monocapa confluente al 90% (aproximadamente 10 x 10⁶ células/matraz T75) en medio de Dulbecco modificado de Iscove completo (IMDMc: IMDM + 10% de suero fetal bovino (FBS) + 1% de penicilina-estreptomicina).
2. Retire el medio y enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aplicar 6 mL de una solución de desprendimiento celular que contenga enzimas proteolíticas y colagenolíticas (ver la Tabla de Materiales), e incubar a 37 °C durante 2 min.
3. Golpee el matraz suavemente para movilizar las células adherentes restantes desde el fondo. Recoja la suspensión celular en tubos de 15 ml y centrifugue a 300 x g durante 7 min y 20 °C.
4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender bien el pellet en 1 mL de PBS. Añadir 14 mL de PBS y centrífuga (300 x g y 20 °C durante 7 min).
5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS.
6. Cuente las células y vuelva a suspenderlas hasta la concentración de 3 x 10⁶/mL de PBS (para el paso 2) o 6 x 10⁶/mL de PBS (para el paso 6) para la inyección. Mantenga las células en hielo durante un máximo de 30 minutos.

>2. Modelo tumoral alogénico en ratones

1. Utilice 10 ratones hembra Ifnar1-/- de 8 a 12 semanas de edad que se mantengan en condiciones libres de patógenos específicos (SPF).
   nota: Los ratones hembra son preferibles en un modelo subcutáneo de crecimiento tumoral, ya que los machos son más agresivos y, por lo tanto, propensos a infringir el sitio del tumor, lo que influye en el crecimiento del tumor.
2. Afeitar la piel del ratón en el flanco con una afeitadora eléctrica y desinfectar la piel con un pañuelo humedecido con etanol al 70%.
3. Recoja las células de melanoma B16F10 preparadas a una concentración de 3 x 10⁶/mL de PBS (consulte el paso 1) en una jeringa de 1 mL y una aguja de 0,4 x 19 mm. Inyectar 100 μL de la suspensión por vía subcutánea.
   1. Mezcle bien las células antes de cada inyección. Utilice agujas de no menos de 0,4 mm de diámetro para no alterar las células tumorales.
4. Coloque hasta 5 ratones en una jaula y controle el tamaño del tumor (longitud, ancho y profundidad) con un calibrador durante 14 días><. nota: De acuerdo con la normativa animal, el tamaño del tumor no debe superar los 15 mm de diámetro, los ratones con tumores más grandes o necróticos/abiertos deben ser sacrificados previamente.
5. En el día 14, sacrifique los ratones en la cámara de CO₂.
6. Desinfecte la piel con etanol al 70% y extirpe los tumores con tijeras y pinzas en una placa de Petri estéril. Mantenga los tumores en un tubo de 50 mL en el medio Eagle Modificado de Dulbecco completo (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) en hielo.

3. Aislamiento de TAN

1. Coloque los tumores en placas estériles de 6 pocillos, 5 tumores por pocillo. Cortar los tumores en trozos de 2-3 mm con unas tijeras estériles.
   1. Digestión con 1 mL de solución de dispasa/colagenasa D/DNasa I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg en 1 mL de DMEMc) por tumor. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ en una incubadora húmeda y mezclar con una jeringa de 10 mL sin aguja cada 15 min 3 veces.
2. Para eliminar las fibras no digeridas, las células se mezclan a través de filtros de 100 μm en tubos de 15 ml (un pocillo por filtro por tubo). Añadir PBS a 15 mL, centrifugar los tubos a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
3. Lise los eritrocitos con un tampón de lisis (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C) añadiendo 1 mL en cada tubo. Mezcle bien y combine la solución de todos los tubos en uno. Detenga la reacción después de 2 minutos con 11 mL de DMEMc helado (4 °C).
4. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con 15 mL de PBS frío. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS. Añadir 3 μL de anticuerpos Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL) e incubar en hielo durante 15 min.
6. Añadir anticuerpos: 10 μL de Ly6G-ficoeritrina (Ly6G-PE, stock 0,2 mg/mL) y 10 μL de CD11b-aloficocianina (CD11b-APC, stock 0,2 mg/mL). Añadir 20 μL de colorante de viabilidad 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI, stock 5 mg/mL) e incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min.
   nota: Se puede utilizar otra combinación de colorantes de viabilidad y conjugados fluorescentes de anticuerpos.
7. Añadir PBS hasta 15 mL, centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender el pellet en DMEMc a una concentración de aproximadamente 10 x 10⁶/mL y manténgalo en hielo.
9. Clasificación de neutrófilos CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-negativos) con un clasificador de células activado por fluorescencia (estrategia de compuerta, ver Figura 2).
   nota: Mantenga el tubo con suspensión de células y el tubo con DMEMc para células clasificadas a 4 °C. Utilice los siguientes ajustes de clasificación óptimos: una boquilla de 70 μm, una tasa umbral de un máximo de 22.000 eventos/segundo y un caudal de 1-3.
10. Compruebe la pureza de los neutrófilos clasificados con un citómetro para obtener una pureza recomendada del >95%.
11. Centrifugar los neutrófilos clasificados a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células clasificadas en DMEMc hasta la concentración de 1 x 10⁶/mL.
    nota: El número esperado de neutrófilos en un tumor B16F10 de 14 días (10 mm de diámetro) es de aproximadamente 3 x 10⁴ células.

>4. Inhibición de NAMPT en TANs in vitro

1. Prepare el caldo FK866 (inhibidor de NAMPT) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 100 mM.
2. Semillas de neutrófilos clasificados (paso 3.11) en 2 pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos (1,5 x 10⁵ neutrófilos/pocillo). Agregue FK866 en el pocillo de intervención (concentración final de 100 nM) y una cantidad igual de DMEMc con DMSO en el pocillo de control. Incubar durante 2 h a 37 °C, 5% CO₂ en una incubadora húmeda.
3. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender 200 μL de PBS en cada pocillo. Repite 2 veces.
4. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Resuspender en un medio comercial de crecimiento de células endoteliales (suplementado con 4 μL/mL de suplemento de crecimiento de células endoteliales, 0,1 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos, 90 μg/mL de heparina y 1 μg/mL de hidrocortisona) hasta una concentración final de 0,2 x 106 células/mL (en 0,75 mL) (para el paso 5) o en PBS hasta la concentración final de 0,6 x 10⁶ células/mL ( en 0,25 mL).

Resultados

Figura 1. El esquema del protocolo. Paso 1. Preparación de la línea celular de melanoma B16F10; 2. Modelo tumoral alogénico en ratones; 3. Aislamiento de los TAN de los tumores; 4. Inhibición de NAMPT en TANs in vitro; 5. Estimación de las propiedades angiogénicas de los TANs en el ensayo del anillo aórtico; 6. Transferencia adoptiva de neutrófilos tratados en el modelo tumoral alogénico; 7. Seguimie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemania	6,25,54,502
Tubos de 50 ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemania	227261
Puntas estériles de 5 ml / 10 ml / 25 ml para la pipeta automática	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemania	6006180 / 607180 / 760180
Placas de cultivo celular de fondo plano de 6 pocillos	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemania	8 millones 33 mil 920
Placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemania	655180
Placas de cultivo celular con fondo en U de 96 pocillos	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemania	65018
anti-ratón CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE. UU.	553312	clon M1/70, conjugado con APC, 0,2 mg/ml
anti-ratón Ly6G	BioLegend, California, EE. UU.	127608	clon 1A8, conjugado con PE, 0,2 mg/mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE. UU.		clasificador de células
calibrador	Vogel Alemania, Kevelaer, Alemania
Contador de células Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Alemania
Filtros estériles Cell Trics 50μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Alemania	04-004-2327 / 04-004-2328
Centrífuga Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Alemania	4706
Colagenasa D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemania	11088858001
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato)	BioLegend, California, EE. UU.	422801	Existencias: 5mg/ml
Dispasa I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemania	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	41966-029	DMEM completo: DMEM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina
DMSO (dimetilsufóxido)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Alemania	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNasa I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemania	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	14190-094
Medio de crecimiento de células endoteliales	PromoCell, Heidelberg, Alemania	C-22010
FBS (Suero Fetal Bovino)	Biochrom, Berlín, Alemania	S0115
Bloque FC (Anti-ratón CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, Estados Unidos	553142	clon 2.4G2, Culata: 0.5mg/mL
Clorhidrato FK 866	Axon Medchem, Groningen, Países Bajos	Axón 1546	Stock: 100 mM
Cabra Anti-Conejo IgG H&L	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB97075	Cy3-conjugado, Stock: 0,5 mg/mL
Incubadora de CO2 Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	12440-053	IMDM completo: IMDM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina
Afeitadora Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, Alemania	90200714
Membrana basal Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Ámsterdam, Países Bajos	7205011
Antiactina monoclonal, músculo liso α	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemania	F3777	Conjugado con FITC, sin información sobre la concentración de existencias
Agujas 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE. UU.	302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Alemania	HX67590916
Suero de cabra normal	Laboratorios Jackson ImmunoResearch, West Grove, EE. UU.	005-000-121
Penicilina Estreptomicina	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	Números 15140-122
Pipetus pipeta automática	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Alemania	9907200
Mountant antidecoloración ProLong Gold con DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	P36935
conejo anti ratón Laminin gamma 1 cadena	Immundiagnostik, Bensheim, Alemania	AP1001.1	No hay información sobre la concentración de existencias
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.	A1105-01
Bisturí para desechar estériles (n.º 15)	MedWare, Nápoles, EE. UU.	120920
Jeringas 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Estados Unidos	303172
Jeringas 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU.	309110
Matraces de cultivo de células estériles T75	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemania	83,39,11,302