Una técnica de conjugación avidina-biotina para presentar antígenos diana en Mycobacterium bovis BCG

Resumen

Fuente: Liao, T. A., et al., Expresión de antígenos exógenos en la vacuna BCG de Mycobacterium bovis a través de la decoración de superficies no genéticas con el sistema Avidin-biotina. J. Vis. Exp. (2018).

El video muestra una técnica para cargar antígenos en Mycobacterium bovis BCG para mejorar sus propiedades inmunogénicas. El método utiliza el sistema avidina-biotina para recubrir la superficie bacteriana con antígenos exógenos.

Protocolo

1. Biotinilación de la superficie celular BCG

1. Cultive BCG en caldo Middlebrook 7H9 con 10% de OADC (solución de ácido oleico, albúmina y dextrosa) y 0.05% Tween 80 a 37 °C en una plataforma agitadora a 50 rpm hasta OD = 0.5-1.
   NOTA: BCG es un patógeno de nivel de bioseguridad 2 y todos los experimentos relacionados con BCG deben realizarse en una cabina de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
2. Lave 10⁹ BCG 3 veces con 500 μL de PBS libre de endotoxinas heladas más 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Suspenda el pellet de BCG en PBS estéril libre de endotoxinas.
3. Inmediatamente antes de usar, prepare 1 mL de 10 mM de biotina Sulfo-NHS SS en agua filtrada estéril.​
   1. Incubar las bacterias con 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Lave las bacterias marcadas 3 veces con 500 μL de PBST frío helado para eliminar el reactivo de biotinilación no reaccionado.
   1. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBST.

>2. Unión de la proteína monomérica de fusión avidina a la superficie biotinilada de BCG

1. Mezclar 5 x 10^{8 BCG} biotinilado con Avi-protein (10 μg/mL final en PBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente en la plataforma agitadora.
2. Lave las bacterias 3 veces con 500 μL de PBST helado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Libre de endotoxinas RPMI 1640	Tecnologías StemCell	36750
Sulfo-NHS SS biotina	Termo Fisher	21328
Caldo Middlebrook 7H9	Sistemas de diagnóstico BD	271310
OADC (en inglés)	Sistemas de diagnóstico BD	B11886
Preadolescente 80	Sigma-Aldrich	Página 1379