Un ensayo para analizar el β-glucano de prueba como estrategia de inmunoterapia contra las células de cáncer cerebral

Resumen

Fuente: Folgado-Dorado, C. et al., Aislamiento y purificación de β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2023)

Este video muestra un ensayo in vitro que utiliza β-glucanos para activar las células microgliales para la producción de radicales superóxido, una especie reactiva de oxígeno. En las células de cáncer cerebral, los oxidantes reactivos generados suprimen activamente la proliferación de células tumorales e inducen la muerte celular.

Protocolo

Estudio in vitro de la estimulación de la microglía inducida por β-glucano

1. Cultivo celular de glioblastoma de ratón y células de microglía en portaobjetos de cámara de 8 pocillos

NOTA: Este protocolo es específico para las líneas celulares GL261 (glioblastoma) y BV2 (microglía). Sin embargo, con ligeras modificaciones, estos pasos podrían utilizarse para estudiar otras líneas de células cancerosas e inmunitarias.

1. Prepare el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) medio completo modificado con L-glutamina, 4,5 g/L de D-glucosa y sin piruvato. Añadir un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Precalentar el material en un baño de agua a 37 °C durante 15 min.
2. Descongele las alícuotas BV2 y GL261 congeladas en un baño de agua (37 °C) durante 2 minutos y, justo antes de que se descongelen por completo, llévelas a una campana de flujo laminar y coloque las células en dos matraces T25 estériles diferentes (uno para cada línea celular).
3. Incubar los matraces T25 a 37 °C, 5% de CO₂ hasta que el cultivo sea confluente.
   nota: Dependiendo de las condiciones de congelación y del tiempo bajo criopreservación, el tiempo hasta la confluencia puede variar. Estas líneas celulares suelen tardar entre 3 y 5 días en alcanzar la confluencia en un matraz T75.
4. Después de que el cultivo celular BV2 se vuelva confluente, transfiéralo a portaobjetos de cámara de 8 pocillos de 0,6 x 10⁶ células/pocillo. Mantenga los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos en la incubadora durante 24 h.
5. Una vez que las células de la microglía se hayan colocado en los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos, repita el mismo protocolo con las células GL261.

>2. Activación de la microglía con β-glucanos

1. Cubrir las células BV2 con cuatro β-glucanos diferentes (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus) a una concentración de 0,2 mg/mL durante 72 h. Una condición experimental debe permanecer sin tratar (medio normal), actuando como grupo de control.
2. Recoja el sobrenadante con una pipeta después de 72 h y pase el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 μm. A continuación, congele el sobrenadante a -80 °C durante al menos 24 h.

>3. Tratamiento de GL261 con medio acondicionado de microglía preactivado

1. Una vez que el GL261 tenga un 80% de confluente dentro de los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos, agregue β medio microglial tratado con glucano a una concentración de volumen final del 25% durante 72 h (volumen total: 250 μl/pocillo).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de cámara de 8 pocillos	Thermo Fisher, EE. UU.	171080
Medio de Eagle modificado de Dulbecco, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.	10564011
Extenda (α--Amilasa/Glucoamilasa)	Novozymes, Dinamarca
Suero fetal bovino	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.	A4736301
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.	Teléfono 1010-015
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich, San Luis	P4458
incubadora	Eppedorf	Galaxy 170S