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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de bazos de ratones
- Preparación 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute): 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 1 mM de piruvato de sodio, 50 μM de β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Eutanasia de ratones machos C57bl/6 de 10 a 12 semanas de edad mediante inhalación de CO2. Rocíe el pecho y los lados del ratón con etanol al 70%. En el lado izquierdo, abra con cuidado la piel y la cavidad peritoneal para exponer el bazo.
- Con pinzas pequeñas, mueva con cuidado los intestinos y el hígado hacia el lado izquierdo del ratón y, con unas tijeras finas, extirpe suavemente el bazo><.
nota: Este paso debe realizarse con mucho cuidado, ya que el daño al tracto gastrointestinal puede inducir contaminación.
- Coloque cada bazo extirpado en un tubo cónico de 15 mL marcado que contenga 3 mL de medio RPMI 1640.
>2. Generación de suspensiones unicelulares a partir de bazos
NOTA: El bazo se puede disociar en una suspensión unicelular combinando la disociación mecánica más la digestión enzimática.
- Prepare la solución de digestión del bazo añadiendo colagenasa D (1 mg/mL; 0,29 U/mg liofilizado) y DNasa I (0,1 mg/mL) al medio RPMI 1640 preparado (ver paso 1.1)
- Use fórceps para transferir el bazo a un tubo C (tubo de disociación) que contenga 3 mL de solución para la digestión del bazo.
- Realice la disociación mecánica utilizando un homogeneizador semiautomático de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Coloque el tubo C en el homogeneizador semiautomático, asegurándose de que el tubo C esté bien colocado en el brazo giratorio. Una vez colocado el tubo C, presione el botón de inicio en el homogeneizador semiautomático para ejecutar el protocolo Spleen 04.01 durante 60 s.
NOTA: La disociación mecánica también se puede realizar colocando un filtro de 40 μm encima de un tubo cónico de 50 mL y moliendo suavemente el bazo a través del filtro. Después de moler el bazo, enjuague el filtro de 40 μm con 10 mL de medio RPMI.
- Después de la disociación mecánica, separe el tubo del homogeneizador y realice la digestión enzimática. Incubar las muestras durante 15 min a 37 °C en rotación continua (20 rpm).
- Transfiera la solución pipeteándola a un tubo cónico de 50 ml después de filtrarla a través de un filtro de 40 μm. Lave el colador de 40 μm con 10 ml de PBS (dPBS) de Dulbecco. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante por completo y lave el pellet resuspendiéndolo en 10 mL de dPBS. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
>3. Aislamiento de CD11c+ DCs de la suspensión de célula única esplénica
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de dPBS y cuente el número de células usando un hemocitómetro y exclusión de azul de tripano.
- Granular las células centrifugando a 300 x g, durante 10 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet en 400 μL de tampón de clasificación de células (MAC) activado magnéticamente.
- Agregue 100 μL de microperlas CD11c (consulte la Tabla de materiales) por 1 x 108 celdas.
- Agitar la suspensión celular e incubar durante 10 min en el refrigerador a 4 °C.
- Agregue 10 ml de tampón MAC para lavar las celdas. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante completamente y volver a suspender en 500 μL de tampón MACs.
>4. Separación magnética de CD11c+ DCs
NOTA: La separación magnética se realiza manualmente con un separador magnético (ver Tabla de Materiales) equipado con Columnas LS. La separación magnética también se puede realizar automáticamente con un separador magnético automatizado. (ver Tabla de Materiales).
- Coloque la columna LS en el campo magnético del separador MAC y un tubo cónico de 15 mL debajo de cada columna para recoger el flujo.
- Enjuague la columna LS con 3 mL de tampón.
- Coloque la suspensión de celdas en cada columna LS y recoja el flujo que contiene celdas sin etiquetar.
- Lave la columna LS con 3 mL de tampón MAC, recogiendo las células sin etiquetar que pasan. Lave la columna LS 2 veces más.
- Retire la columna LS del separador magnético. Agregue 5 mL de tampón MACs a cada columna y enjuague inmediatamente las celdas marcadas magnéticamente sumergiendo firmemente la columna LS en un tubo cónico limpio de 15 mL.
nota: Es importante realizar un doble aislamiento de las células CD11c para obtener una suspensión celular de alta pureza. Por lo tanto, repita los pasos 3.1 a 4.5. y la Figura 4 de referencia para los estándares de pureza. Este paso mejora la pureza de las células CD11c+ al 90-95%.
- Determine el número de CD CD11c+ en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul de tripano. Diluir la muestra de células en una dilución 1:1 en una solución de azul de tripano al 0,4%.
NOTA: Las células no viables se teñirán de azul, mientras que las células viables permanecerán sin teñir.
- Para hacer esto, llene cuidadosamente un hemocitómetro con 10 μL de la dilución de la muestra de células e incube durante 1 minuto.
- Cuente las celdas en 4 cuadrados de 1 x 1 mm2 en la cámara que se ha cargado para determinar el número de celdas viables.
5. Tratamiento in vitro con alto contenido de sal de CD11c+ DC
- Prepare el medio de cultivo de DC agregando 10% de FBS, 0,1 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μM de β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina a 500 mL 1640 RPMI.
- Prepare 10 medios de cultivo de células con alto contenido de sal en CC (400 mM) pesando 1,17 g de NaCl y colocándolos en un tubo falcon estéril de 50 ml. Añada 50 mL de medio de cultivo de células DC estériles (preparado en el paso 5.1) al tubo de halcón de 50 mL y al vórtice hasta que el NaCl esté en solución.
- Filtre inmediatamente los medios de cultivo de CC con alto contenido de sal mediante filtración al vacío a través de un filtro de 0,2 μm en una campana de cultivo celular.
- Centrifugar cada suspensión celular del bazo a 300 x g durante 10 min a 4ºC. Resuspender cada pellet celular en medios de cultivo DC a una concentración de 1 x 106 células/mL.
- Pipetee 900 μL (aproximadamente 1 x 106 celdas) de la suspensión de CC en una placa Falcon de fondo plano de 24 pocillos. Agregue 100 μL de medio de cultivo de CC con alto contenido de sal a cada pocillo para obtener una concentración final de sodio de 190 mM. Etiquete la placa y colóquela en una incubadora deCO2 humificado a 37 °C durante 48 h.
>6. Transferencia adoptiva de CD11c+ DCs tratados con alto contenido de sal
- Después de la estimulación in vitro durante 48 h, retire la placa de la incubadora de CO2 humificado a 37 °C.
- Pipetea los medios de cultivo celular hacia arriba y hacia abajo para resuspender las CD CD11c+. Pipetea toda la suspensión de CD11c+ DC en un tubo de 1,6 ml etiquetado correspondiente. Repita este paso para cada individuo bien emplatado.
- Centrifugar cada suspensión de CC CD11c+ a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de CC con 100 μL de dPBS estéril.
- Extraiga la suspensión de CC en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 27 G 1/2 pulgada.
- Coloque a los ratones machos C57bl/6 de 10 semanas de edad bajo un 2% de isoflurano para lograr un plano quirúrgico estable. Compruebe el nivel de anestesia con la falta de reflejo pedal. Una vez que se logra un plano quirúrgico estable, introduzca lenta y cuidadosamente la aguja en el espacio retroorbital en un ángulo de aproximadamente 30°.
nota: El bisel de la aguja de 27 G debe apuntar hacia abajo, lejos del ojo, para evitar daños oculares.
- Inyecte lenta y suavemente la suspensión de CC CD11c+ (aproximadamente 1 x 106 celdas). Una vez completada la inyección, retire con cuidado la aguja del espacio retroorbital siendo consciente de no dañar el ojo><.
nota: Después de la inyección, debe haber poco o ningún sangrado. La transferencia adoptiva de CD11c+ DC también se puede realizar utilizando un método de inyección intravenosa (por ejemplo, vena de cola). Los ratones de control recibieron CD11c+ DC que se cultivaron en medios salinos normales.
- Retire los ratones del cono de la nariz y manténgalos monitoreados durante aproximadamente 30 minutos durante la recuperación de la anestesia.