Obtención de imágenes de células beta transgénicas en un ratón inmunodeficiente desafiado con esplenocitos diabéticos

Resumen

Fuente: Stewart, T. et al., Monitorización bioluminiscente de la supervivencia del injerto en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones.J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra un método basado en imágenes para visualizar células beta trasplantadas que expresan luciferasa en un ratón diabético inmunodeficiente no obeso. La introducción de esplenocitos de un ratón diabético conduce a la destrucción progresiva de las células beta, confirmada visualmente por la disminución de la luminiscencia después de la introducción del sustrato.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ingeniería y mantenimiento de líneas celulares NIT-1

1. Mantener las líneas celulares NIT-1, que comparten un fondo genético con ratones diabéticos no obesos (NOD), y las células 293FT en placas tratadas con cultivo de tejidos en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de glucosa suplementada con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Haga crecer las células de 293FT hasta un 70%-80% de confluencia para la transfección.
3. Por plato de 10 cm de células 293FT, combine 10 μg de pLenti-luciferasa-blast (ver Archivo Suplementario 1), que expresa el transgén luciferasa de luciérnaga (luc2) bajo el control del promotor EF1α constitutivamente activo, 2 μg de cada uno de los plásmidos de empaquetamiento pMD2.G, pMDLg/pRRE y pRSV-Rev, 4 μg del plásmido de proteína de envoltura pCMV-VSV-G, y 60 μg de polietilenina lineal (PEI) en 1 mL de DMEM sin suero. Ajuste las cantidades en función del número de células que se van a transfectar.
4. Deje el ADN, el PEI y el DMEM a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos y luego agréguelos a las celdas 293FT.
5. Recoja el medio que contiene las partículas lentivirales 48 h después de la transfección.
6. Transducir las células NIT-1 a ~80% de confluencia con 1 mL de medio que contenga partículas lentivirales por cada 10⁶ células durante 48-72 h.
7. Seleccione las células que expresan luciferasa con 5 μg/mL de blasticidina durante 48 h.
8. Además, modificar genéticamente las células que expresan luciferasa para adaptarlas a la cuestión experimental. Incluya una línea celular de control de tipo salvaje o no objetivo que exprese luciferasa para comparar.
   nota: Algunos ejemplos de modificaciones de genes diana son el knockout de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), CRISPRa/i, la reducción de shRNA y la sobreexpresión.

>2. Preparación de células NIT-1 para trasplante

1. Haga crecer las células que expresan luciferasa hasta que tengan un 80%-90% de confluentes.
2. Retire el medio de crecimiento y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 5 ml para un plato de 10 cm).
3. Agregue 1 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético al 0,05% (tripsina-EDTA) a cada plato durante 2 minutos.
4. Neutralizar la tripsina con 5 mL de medio de crecimiento.
5. Utilice una pipeta para lavar las células del plato y transferirlas a un tubo cónico.
   nota: Se pueden combinar células de varios platos de la misma línea celular.
6. Cuente las células utilizando una tinción como el azul de tripán manualmente con un hemocitómetro o automáticamente con un contador automático de células.
7. Centrifugar a 250 × g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante con una pipeta de aspiración.
8. Vuelva a suspender el pellet celular en PBS a una concentración de 5 × 10⁷ células/mL (se trasplantarán 10⁷ células por línea celular por ratón en un volumen de 200 μL).
9. Mantenga las células en hielo (hasta por 3 h) hasta el trasplante.

>3. Trasplante de células NIT-1 en ratones diabéticos no obesos con inmunodeficiencia combinada grave (NOD-scid)

1. Anestesiar a los ratones receptores (ratones NOD-scid de 8-10 semanas de edad del mismo sexo que los ratones utilizados para aislar los esplenocitos) mediante inhalación de isoflurano en una cámara de derribo. Suministrar isoflurano al 2,5% en la cámara a un caudal de 1,5 L/min y una tasa de evacuación de 9 L/min.
2. Lubrique los ojos del animal con ungüento oftálmico para evitar que se sequen.
3. Con una afeitadora eléctrica con un protector, retire el vello de la parte posterior (lado dorsal) de los ratones para exponer la piel. El área de trasplante afeitada será de aproximadamente 1 pulgada x 2 pulgada. Regrese los ratones afeitados a la cámara de derribo hasta el trasplante.
4. Transfiera los ratones uno a la vez a una superficie limpia con un cono nasal de isoflurano. Guía suavemente la cabeza del ratón hacia el cono de la nariz. Utilice un caudal de isoflurano de 0,25 L/min para mantener la anestesia durante el trasplante.
5. Limpie el área del trasplante con una almohadilla de preparación con alcohol isopropílico para eliminar el cabello suelto y desinfectar la piel.
6. Asegúrese de que las células estén completamente resuspendidas antes de cargar la jeringa. Extraiga un volumen excesivo (>300 μL) de células en una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de 26 G. Retira las burbujas; luego devuelva el exceso de células al tubo para que permanezcan 300 μL de suspensión celular en la jeringa.
7. Con un par de pinzas curvas sostenidas en la mano no dominante, levante suavemente la piel de un lado (izquierdo o derecho) de la espalda del ratón para permitir un acceso más fácil al espacio subcutáneo.
8. Con la mano dominante, coloque la jeringa paralela a los planos coronal y sagital del cuerpo del ratón. Con la aguja apuntando hacia la cabeza del ratón, inserte la aguja en la piel cerca de los cuartos traseros y guíela suavemente hacia el espacio subcutáneo. Asegúrese de que toda la aguja permanezca debajo de la piel y no se atraviese.
9. Ajuste las pinzas para sujetar suavemente la piel alrededor de la base de la aguja. Dispense lentamente una pequeña cantidad de suspensión celular (<50 μL) y confirme que se forma una pequeña protuberancia debajo de la piel en el lugar de la inyección. Continúe inyectando la suspensión celular hasta que se hayan administrado 200 μL al espacio subcutáneo.
10. Sosteniendo las pinzas en su lugar y manteniendo la aguja paralela al cuerpo del ratón, retire lentamente la aguja. Después de retirar la aguja, mantenga la piel cerrada con pinzas durante unos segundos para evitar que las células se escapen de la herida punzante.
11. Si se está evaluando una modificación genética, repita el trasplante en el lado opuesto del ratón usando una jeringa diferente para que se inyecten tanto las células mutantes como las de control en cada ratón, con una línea celular a la izquierda y la otra a la derecha. Si solo se va a trasplantar una línea celular, inyecte las células en un solo lado.
12. Después del trasplante, transfiera cada ratón a una jaula nueva. Permita que cada ratón se recupere completamente de la anestesia antes de agregar ratones adicionales a la jaula><. nota: Los ratones se recuperan cuando reanudan sus actividades normales y no muestran signos de letargo o deterioro del movimiento.
13. Evalúe el estado de salud de los ratones diariamente durante la duración del experimento después del trasplante. Si los injertos forman una gran protuberancia o los ratones se vuelven débiles y letárgicos, mida su glucosa en sangre y proporcione agua con sacarosa al 10% (p/p) ad libitum a todos los ratones hipoglucémicos. Siga todas las recomendaciones veterinarias y eutanasione a cualquier ratón con una condición corporal deficiente continua según las pautas institucionales. En este estudio, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical.

>4. Aislamiento y purificación de esplenocitos autorreactivos

1. Identifique ratones NOD machos o hembras de 10 a 16 semanas de edad con diabetes de inicio reciente (menos de 10 días) mediante el uso de tiras reactivas de glucosa en orina (o sangre). Los ratones NOD se consideran diabéticos cuando tienen una concentración de glucosa en orina/sangre ≥250 mg/dL durante al menos 2 días consecutivos.
   nota: Por cada ratón NOD-scid se necesitan 10 millones de esplenocitos; Un bazo suele producir entre 50 y 150 millones de esplenocitos. Los esplenocitos se aislaron de ratones libres de patógenos alojados en una instalación monitoreada por centinelas.
2. Sacrificar el número adecuado de ratones NOD diabéticos.
   nota: En este estudio, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical para asegurar la muerte.
3. Con el ratón en su espalda, haga una incisión vertical de aproximadamente 2 pulgadas de largo en la piel con unas tijeras quirúrgicas. Abra el lado derecho del ratón desde el punto de vista del investigador y localice el bazo rojo brillante. Corte suavemente el bazo del páncreas rosado y transfiéralo a una placa de Petri estéril de 10 cm que contenga 5 ml de PBS estéril. Repita la disección con tantos ratones como sea necesario.
   nota: Los bazos de varios ratones se pueden combinar en un plato. Lleve a cabo los siguientes pasos utilizando reactivos estériles y equipos en una funda estéril.
4. Machaca el bazo con la parte superior plana de un émbolo de jeringa estéril.
5. Coloque un colador de 40 μm o 70 μm en un tubo cónico de 50 mL y lave el colador con 5 mL de PBS para cebarlo. Transfiera la suspensión del bazo al colador y continúe machacando suavemente a través del colador. Lave el plato con 10 ml de PBS y transfiera el lavado al colador. Continúe machacando hasta que el color rojo desaparezca del colador.
6. Deseche el colador y centrije el tubo a 500 × g durante 5 min a RT. Retire el sobrenadante con una pipeta de aspiración.
7. Vuelva a suspender el gránulo de células en 5 mL (para hasta tres bazos) de tampón de lisis ACK precalentado a RT y lise los glóbulos rojos durante 4 min. Aumente el volumen en 1-2 mL por bazo si se necesitan bazos adicionales.
8. Detenga la reacción con 5 mL de medio celular NIT-1 (descrito anteriormente) por 5 mL de tampón de lisis. Pase la suspensión de celdas a través de un colador nuevo para eliminar los grumos. Deseche el colador y gire a 500 × g durante 5 min a RT.
9. Vuelva a suspender el pellet de celda en 20 mL de PBS y cuente las celdas. Centrifugar a 500 × g durante 5 min en RT. Vuelva a suspender las células en PBS estéril a una concentración de 1 × 10⁸ células/ml (el volumen de inyección es de 0,1 ml/ratón) en un tubo de reacción de bloqueo seguro de 1,5 ml.
10. Almacene las células en hielo (durante no más de 1 hora) o mantenga las células en RT, y proceda a la inyección de la vena de cola inmediatamente.

>5. Inyección intravenosa de esplenocitos diabéticos a través de la vena lateral de la cola

1. Calentar el cuerpo de los ratones NOD-scid receptores adultos (por ejemplo, usando una lámpara de calor durante ~5-10 min) para vasodilatar las venas (esto ayuda a la visualización e inyección en la vena).
   nota: Para evitar el sobrecalentamiento de los ratones, no exceda este tiempo. Supervise siempre el estado de salud. Si los ratones parecen agotados o inmóviles, apague la lámpara de calor inmediatamente.
2. Calienta la suspensión de la celda. Prepare una jeringa estéril (0,3-1,0 mL) con una aguja estéril (27-30 g, 0,3 mm/0,5 pulgadas o más pequeña), o use una jeringa de insulina estéril de 0,5 ml con una aguja de 0,3 mm (0,5 pulgadas). Mantenga siempre la aguja estéril y utilice una bandeja estéril si es necesario dejar la jeringa entre inyecciones.
3. Vuelva a suspender la solución de esplenocitos antes de cada inyección. Para cada ratón, extraiga 100 μL de la suspensión de esplenocitos precalentada y mezclada en la jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa o en la suspensión.
   nota: Asegúrese de tener todo el equipo y los suministros preparados (toallitas con alcohol para la desinfección, una jeringa cargada con los esplenocitos que se van a inyectar y una jaula nueva para separar a los ratones inyectados) antes de colocar al ratón en el dispositivo de sujeción.
4. Coloque el ratón en el dispositivo de sujeción. Captura la cola con la mano no dominante y localiza una de las dos venas laterales de la cola. Gire suavemente la cola si es necesario. Limpie la cola con una toallita desinfectante (alcohol isopropílico al 70%) para limpiar la piel y aumentar la visibilidad de la vena.
5. Inserte la aguja en un ángulo agudo en la región central de la cola con la mano dominante. Con el bisel de la aguja hacia arriba, deslice la aguja unos milímetros a través de la piel.
   nota: Asegúrese de que la aguja esté paralela a la vena y colocada ligeramente debajo de la piel. Esté preparado para los movimientos bruscos del ratón/cola directamente después de penetrar en la piel/pared del vaso. Una inserción exitosa de la aguja debe sentirse como un "deslizamiento suave" en la vena. Si se necesita otro intento, muévase más arriba de la cola hacia el cuerpo.
6. Aplique una presión suave a la jeringa para inyectar la suspensión de esplenocitos. No permita que la aguja se mueva más hacia adentro o hacia afuera durante la inyección. Las inyecciones exitosas son suaves, sin sentir contrapresión durante la inyección y están indicadas por un flujo sanguíneo transparente/blanco inmediatamente después de la inyección.
7. Suelte suavemente la aguja fuera de la vena y aplique una ligera presión en la cola con una toallita desinfectante hasta que se detenga el sangrado. Suelte el ratón del dispositivo de sujeción y transfiéralo suavemente a una jaula recién preparada.
   nota: Inyecte dos o tres ratones de control que no reciben un trasplante de células NIT-1 con esplenocitos para confirmar el potencial de los esplenocitos autorreactivos para inducir diabetes, lo que toma aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la inyección.

>6. Imágenes bioluminiscentes in vivo de injertos NIT-1

NOTA: Visualice los injertos una o dos veces por semana. El día del trasplante, espere al menos 2 h después del trasplante para permitir que los injertos se asienten y aseguren una expresión estable de luciferasa. Si el tiempo es un factor limitante, la medición inicial se puede tomar el día 1. Un programa de imágenes inicial recomendado es el Día 0 o el Día 1 después de la inyección, el Día 5, el Día 10, el Día 14, el Día 18 y el Día 25. Sin embargo, ajuste el horario en función del progreso de la autoinmunidad a juzgar por la pérdida de señal bioluminiscente.

1. Prepare una solución de D-luciferina de 15 mg/mL en el PBS de Dulbecco. Agitar a RT para que se disuelva, y filtro estéril (0,22 μm). Almacene alícuotas de 1 mL a -20 °C y descongele según sea necesario.
   nota: Las alícuotas se pueden volver a congelar.
2. Al menos 5 minutos antes de la toma de imágenes, inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 g con solución de D-luciferina a una dosis de 150 mg/kg.
   nota: Use una jeringa y una aguja nuevas para cada ratón.
3. Anestesiar a los ratones por inhalación de isoflurano de acuerdo con las directrices institucionales. Las condiciones recomendadas son isoflurano al 2,5% con un caudal de 1,5 L/min en la cámara de desmontaje y una tasa de evacuación de 9 L/min.
4. Lubrique los ojos del animal con ungüento oftálmico para evitar que se sequen.
5. Abra el software asociado con el instrumento de imagen. Crear un nuevo usuario y/o inicio de sesión. En el panel de control de la parte inferior derecha, seleccione Inicializar (Figura 1A). Para guardar automáticamente los datos de imágenes, cree las carpetas adecuadas en el equipo y, a continuación, seleccione Adquisición | Guardar automáticamente en... (Figura 1A). Una vez que el instrumento haya terminado de inicializarse, ajuste el tiempo de exposición a 1 min.
   nota: Los parámetros completos de la imagen se muestran en la Figura 1B.
6. Transfiera los ratones de uno en uno desde la cámara de desmontaje al instrumento de imagen. Coloque al ratón boca abajo con las extremidades separadas y guíe suavemente su cabeza hacia el cono de la nariz. Un caudal de isoflurano de 0,25 L/min administrado a través de un cono nasal es apropiado para mantener la anestesia durante la toma de imágenes. Aplana suavemente el ratón presionando el centro de su espalda con ambas manos y luego separando las manos hacia afuera y separándolas.
7. Seleccione Adquirir (Figura 1B). Registre cualquier detalle relevante del experimento en la ventana emergente (Figura 1C).
   nota: Consulte la Figura 2A para ver imágenes representativas de tres ratones hembra NOD-scid de 8 semanas de edad trasplantados con dos injertos en varios puntos de tiempo.

Resultados

Figura 1: Capturas de pantalla de los comandos del software para obtener imágenes de injertos bioluminiscentes. (A) Antes de la toma de imágenes, seleccione Initialize (Inicializar) para preparar el instrumento. Las imágenes se pueden guardar automáticamente en una carpeta de su elección seleccionando Adquisición | Guardar automáticamente en....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA	Corning	25-052-CI
293 PIES	Invitrogen	R70007	Aislado clonal de crecimiento rápido y altamente transfectable derivado de células de riñón embrionarias humanas transformadas con el antígeno T grande SV40
Búfer de lisado ACK	Gibco	A10492-01
Almohadillas de preparación con alcohol, 70% de alcohol isopropílico	Amazon/Ever Ready Primeros Auxilios	B08NWF31DX
BD 5ml Jeringa Luer-Lok Punta	Bd	309646
Aguja BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q	Bd	305115
BD 1 mL TB Punta deslizante	Bd	309659
Blasticidina S HCl	Corning	30-100-RB
Filtro de células premium SureStrain, 70 μm, estéril	Equipo de laboratorio del sur	C4070	O use un colador estéril similar con un tamaño de poro de 40-70um
Contador de células automatizado CellDrop	Denovix	CellDrop BF-PAYG	O use un dispositivo de contador de células similar
Corning 100 mL de solución de penicilina-estreptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
Pipetas aspiradoras desechables, poliestireno, estériles, capacidad=2 mL	VWR	414004-265	O utilice una pipeta de aspiración similar
D-Luciferina, Sal de Potasio, Grado de Biología Molecular, Polvo, >99%	Biografía de oro	SUERTE-100
DMEM, glucosa alta, piruvato, sin glutamina	Gibco	10313039
Tubos Falcon BD, 50 mL	Fisher Científico	14-959-49A
Suero Fetal Bovino	Gibco	10437-028
Pinzas premium para tejidos, 1 x 2 dientes de 5 pulgadas, acero alemán	Fisher Científico	Llame al 13-820-074
Tira reactiva de glucosa en orina	Farmacia para mascotas de California	u-TSG100	O use una tira reactiva similar para medir la glucosa en orina/sangre
GlutaMAX–1 (100x)	Gibco	35050-061
Lámpara calefactora infrarroja	Cole Parmer	03057-00	O use una lámpara infrarroja similar
Jeringa de insulina 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 in	Becton Dickinson	309306
Isoflurano, USP	Cuidados Intensivos Piramal	6679401725
Sistema de imagen in vivo IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Instrumento para la recogida no invasiva de imágenes bioluminiscentes de células trasplantadas
Software de análisis de imágenes vivas	Perkin Elmer	128113	Software para la recogida y cuantificación de señales bioluminiscentes
Tubos de microcentrífuga seal-rite, 1,5 mL	Científico de EE. UU	1615-5510	O utilice tubos de microcentrífuga estériles similares
NIT-1	ATCC	CRL-2055	Línea pancreática beta-celll derivada de ratones NOD/Lt
cabeceo. Cg-Prkdcscid/J	El Laboratorio Jackson	Año 1303	Los ratones homocigotos para la mutación espontánea de inmunodeficiencia combinada grave Prkdcscid, comúnmente conocida como scid, se caracterizan por una ausencia de células T y células B funcionales, linfopenia, hipogammaglobulinemia y un microambiente hematopoyético normal.
NOD/ShiLtJ	El Laboratorio Jackson	Año 1976	La cepa de ratones NOD/ShiLtJ (comúnmente llamada NOD) es un modelo poligénico para la diabetes autoinmune tipo 1
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010031	Sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol
pCMV-VSV-G	Addgene	8454
pLenti-luciferasa-blast	Hecho en casa	Plásmido disponible bajo pedido	Ver Archivo Complementario 1
pMD2.G	Addgene	12259
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
Polietilenimina, lineal, MW 25.000, grado de transfección (PEI 25K)	Fisher Científico	NC1014320
pRSV-Rev	Addgene	12253
Protector para roedores, estilo escoba redondo 1 in	Fisher Científico	01-288-32A
Tijeras, de punta afilada	Fisher Científico	08-940	O use otras tijeras hechas de acero inoxidable de grado quirúrgico
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	O use otras placas de Petri tratadas con cultivo de células estériles
Pinzas/Pinzas, precisión fina con punta media	Fisher Científico	Teléfono 12-000-157