Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Materiales y reactivos
- Utilice mosquitos hembra Anopheles stephensi (cepa Sda500) que se alimentan de ratones infectados de 3 a 5 días después de la emergencia y se crían como se describió anteriormente.
- Utilice el clon de Plasmodium berghei ANKA que expresa el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor constitutivo de la proteína de choque térmico 70 (HSP70). Esto produce una fluorescencia brillante durante todo el ciclo de vida del parásito.
- Utilice ratones hembra C57BL/6JRj (7 semanas de edad).
nota: Todos los reactivos utilizados en el protocolo descrito se enumeran en laCarta de Materiales/Equipos.
>2. Aislamiento de esporozoítos atenuados por radiación de las glándulas salivales de los mosquitos
- Entre 18 y 25 días después de la ingesta de sangre infecciosa, recoja y anestesie en frío a los mosquitos en un tubo de 15 ml con hielo como se describió anteriormente. Transfiéralos con cuidado a una placa de Petri invirtiendo el tubo. Mantenga los insectos en hielo y exponga a los mosquitos a una dosis de 12 krad de irradiación γ o x.
- Aísle los esporozoítos atenuados de las glándulas salivales de los mosquitos irradiados como se describió anteriormente. Recoja las glándulas salivales infectadas en un pequeño volumen (alrededor de 15 μl) de 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco en hielo y tritúrelas suavemente para liberar esporozoítos.
nota: Dado que la inyección de una suspensión de parásitos altamente concentrada en un volumen pequeño es crítica, por lo que es esencial recolectar un número suficiente de glándulas salivales de un gran número de mosquitos bien infectados preseleccionados, como lo demuestra su robusta expresión de fluorescencia verde.
- Filtre la suspensión de esporozoíto a través de un tapón de filtro de células de 35 μm adaptado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de baja adherencia para eliminar los grumos y los restos de mosquitos.
- Cuente el número total de esporozoítos aislados como se describió anteriormente y ajuste la concentración de suspensión de parásitos con DPBS en frío 1x para obtener 83.000 esporozoítos/μl. Almacene los parásitos en hielo mientras continúa con los siguientes pasos.
- Recoja el número equivalente de glándulas salivales de mosquitos no infectados que se utilizarán como control negativo y procese la muestra como se describe en los pasos 2.2 y 2.3. Diluya la muestra como se indicó anteriormente para obtener una concentración similar de extractos de glándulas salivales en la suspensión.
nota: Los esporozoítos se pueden almacenar en hielo durante un máximo de 2 horas. Sin embargo, lo ideal es inyectarlos una hora después de triturar las glándulas salivales.
>3. Inyección de esporozoítos en la capa dérmica del oído
- Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina (50 mg/kg)/xilacina (5 mg/kg). Espere de 5 a 8 minutos para que el ratón esté en un estado de inconsciencia y aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Evalúe la profundidad de la anestesia realizando un suave pellizco en los dedos de los pies en ambos pies traseros.
nota: La dosis de anestesia dura menos de 20 min, por lo que los siguientes pasos deben realizarse rápidamente.
- Estabilice el pabellón auricular del ratón fijando el lado ventral con cinta transparente previamente colocada debajo de un microscopio estereoscópico (Figura 1A). Presione suavemente la oreja para evitar daños en la vasculatura.
- Cargue una jeringa de 10 μl/aguja biselada de calibre 35 con 0,6 μl de parásitos resuspendidos.
- Administre la suspensión de esporozoíto en 4 puntos de inyección (0,15 μl por centro) introduciendo cuidadosamente la aguja en la parte dorsal de la oreja (Figura 1A), debajo de la epidermis, con el bisel hacia arriba, teniendo cuidado de evitar cualquier vaso sanguíneo. Deje que la aguja permanezca en la dermis durante unos segundos para evitar el reflujo del inyector antes de retirarlo. Observe una pápula característica en cada sitio de inyección al final del procedimiento (Figura 1B y 1C).
- Después de la inyección, retire con cuidado la oreja de la cinta.
- Inyecte en el oído contralateral la misma dosis de parásitos siguiendo los pasos 3.2-3.4.
- Inyecte a 2 ratones adicionales 0,6 μl de 1x DPBS o 0,6 μl de 1x DPBS + extracto de glándulas salivales de mosquitos no infectados para evaluar la respuesta inflamatoria mediada por la inyección sola y la deposición de material de mosquito en la dermis.
- Supervise la recuperación del ratón de la anestesia antes de volver a colocarlo en la jaula.
nota: La deposición adecuada de esporozoítos en la piel se puede monitorear mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A y 2B), preparándose el ratón como se describió anteriormente.
