1. Cultivo de iPSCs humanas (hiPSCs) en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)
NOTA: También se pueden utilizar métodos alternativos para el cultivo de hiPSCs, incluyendo pero no limitado a la siembra en una placa de 6 pocillos pre-recubierta con gelatina, una mezcla de proteínas gelatinosas, laminina recombinante 511, o cualquier otra matriz extracelular utilizada en la expansión de hiPSCs, y cultivados utilizando medios definidos especialmente formulados para el cultivo de células madre pluripotentes humanas.
- Cultivo de MEF
- Cubrir una placa de Petri de cultivo celular de 10 cm con 4 mL de gelatina al 0,1% e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Descongele rápidamente un vial de 4 x 106 6 MEF irradiado en 10 mL de medio MEF a 37 °C (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% de suero fetal bovino (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina + 1x suplemento de L-glutamina). Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de la célula en 9 mL de medio MEF.
- Retire el plato recubierto de gelatina de la incubadora. Aspire la gelatina y agregue 7 mL de medio MEF. Coloque 3 mL de suspensión de MEF (del paso 1.1.2) en la placa recubierta de gelatina. Mueva el plato de lado a lado y de adelante hacia atrás para garantizar una distribución uniforme de MEF sobre el plato. Incubar a 37 °C durante 8-36 h.
- Pasando hiPSC en MEF
NOTA: Los datos se generaron utilizando el antígeno de melanoma reconocido por las células T 1 (MART-1) iPSC derivadas de linfocitos infiltrantes de tumores de melanoma (TIL) cultivados a largo plazo, que reconoce específicamente el péptido MART-1 en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA)-A*02:01.
- Pasa las hiPSC cuando las colonias tienen entre 0,8 y 1,2 mm de diámetro. Antes de pasar el cultivo, compruebe las colonias de hiPSC en un microscopio estereoscópico y elimine cualquier área de diferenciación del cultivo utilizando el borde de plástico de una punta de 200 μL.
- Aspire el medio gastado y agregue 10 mL de medio hiPSC (medio de cultivo de células madre embrionarias humanas [ES] [Tabla de materiales] + 10 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos [hbFGF]) suplementado con 10 μM de inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK).
- Sostenga la placa de cultivo celular con una mano y haga rodar una herramienta de paso celular desechable a través de toda la placa en una dirección. Aplique suficiente presión para que toda la cuchilla del rodillo toque la placa de cultivo y mantenga una presión uniforme durante la acción de laminación.
- Gire la placa de cultivo a 90° y repita el paso 1.2.3. Observe la placa en el microscopio para confirmar visualmente el corte adecuado de las colonias, que deben aparecer a cuadros. Separe las colonias cortadas mediante un lavado mecánico suave con una pipeta de 200 μL.
nota: El desprendimiento de las colonias cortadas por lavado mecánico debe realizarse inmediatamente después de cortar las colonias con el rodillo porque después de 3 minutos, las colonias cortadas comenzarán a volver a adherirse al plato y será difícil separar las colonias de tamaño homogéneo mediante lavado.
- Transfiera 350 - 600 grupos de colonias cortadas a un nuevo plato de 10 cm de MEF (sembrado 8 - 36 h antes del paso de hiPSC) con 10 mL de medio hiPSC fresco suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK. Incubar a 37 °C.
NOTA: 600 grupos representan aproximadamente 1.0 x 106 MART-1 iPSC y producirán 0.5-1.0 x 106 celdas DP en el día 35. Sin embargo, los números esperados variarán dependiendo de la potencia de la línea celular inicial y las condiciones de cultivo.
- Al día siguiente, aspire los medios gastados y agregue 10 ml de medios hiPSC nuevos. Cambie los medios de hiPSC cada 1-2 días, dependiendo de la tasa de crecimiento de hiPSC.
>2. Preparación de células OP9/DLL1 para cocultivo con hiPSCs
- Cultivo de células OP9/DLL1 en medio OP9 [α-medio esencial mínimo (α-MEM) + 20% de suero fetal bovino (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina] a 37 °C. Cuando las células OP9/DLL1 alcancen la confluencia, aspire el medio y lávese una vez con 5 ml de solución salina tamponada (PBS) sin fosfato (PBS) sin magnesio, calcio y fenol 1x.
- Aspire PBS y agregue 2 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C. A continuación, añada 4 ml de medio OP9 y disocie mecánicamente la capa de células pipeteando para crear una suspensión de una sola célula.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL a través de un filtro celular de 100 μm para evitar la formación de grumos celulares. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 12 mL de medio OP9.
- Añada 8 mL de medio OP9 a seis nuevas placas de Petri de cultivo celular de 10 cm. Coloque 2 mL de suspensión de celdas OP9/DLL1 del paso 2.3 en cada nueva placa de 10 cm. Mueva el plato de lado a lado y luego de adelante hacia atrás para garantizar una distribución uniforme de OP9/DLL1 sobre el plato.
- Incubar a 37 °C. Repetir el paso cada 2 o 3 días cuando las células alcancen la confluencia.
nota: Es importante hacer suficiente stock congelado de células OP9/DLL1 y descongelar un nuevo stock cada 4-6 semanas.
>3. Diferenciación in vitro de hiPSCs en linfocitos T positivos simples (SP) CD8αβ+
- Prepare placas gelatinizadas OP9/DLL1 una semana antes del cocultivo con hiPSCs. Para preparar una solución de gelatina al 0,1%, agregue 5 mL de solución de gelatina de grado tisular a temperatura ambiente (RT) a 500 mL de PBS.
- Cubra 3 nuevas placas de Petri de cultivo celular de 10 cm añadiendo 4 mL por placa de gelatina al 0,1%. Incubar 30 min a 37 °C.
- Aspire la gelatina y agregue 8 mL de medio OP9 a cada plato. Pase una placa confluente de OP9/DLL1 (como se hizo en la sección 2 anterior) a tres placas prerrecubiertas de gelatina.
- Después de 4 días, agregue 10 mL de medio OP9 a cada plato de 10 cm de OP9/DLL1 en gelatina para obtener 20 mL de medio por plato.
- Después de 7 a 8 días, comience el cocultivo hiPSC en placas confluentes OP9/DLL1 (día 0 de diferenciación).
- Aspire los medios gastados de una placa confluente de 10 cm de hiPSC en MEF. Agregue 10 mL de medio OP9. Corte y separe las colonias de hiPSC utilizando una herramienta de paso de celdas desechable, como se hace en los pasos 1.2.3 y 1.2.4.
- Transfiera de 350 a 600 grupos de colonias cortadas a una placa OP9/DLL1 pregelatinizada de 10 cm (paso 3.1) con 10 mL de medio OP9 fresco utilizando una pipeta de 200 μL. Meca el plato de cultivo de lado a lado y luego de adelante hacia atrás para asegurar una distribución uniforme de las colonias.
nota: Alternativamente, se pueden utilizar cuerpos embrioides (EB) hiPSC preformados o una pequeña suspensión de grupo. Sin embargo, se prefiere el uso de una herramienta de paso de celdas desechable o un sistema de formación de EB para producir grupos de hiPSC de tamaño uniforme.
- El día 1, aspire el medio gastado y reemplácelo con 20 mL de medio OP9 fresco. Los grupos de hiPSC cocultivados en OP9/DLL1 durante 1 día aparecerán como pequeñas colonias redondas de monocapa (Figura 1).
- En el día 5, aspire 10 mL de medio gastado y agregue 10 mL de medio OP9 fresco. Las colonias de hiPSC comenzarán a diferenciarse en un mesodermo primitivo, caracterizado por un centro oscuro de múltiples capas.
- El día 9, aspire 10 ml de medio gastado y agregue 10 ml de medio OP9 nuevo. En este punto, las estructuras centrales de múltiples capas evolucionarán hacia formas de cúpula, y se hará evidente un área periférica similar a una red.
- En el día 13, recoja las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) (Figura 1). Las estructuras derivadas de hiPSC en el día 13 se caracterizan por un organoide central oscuro rodeado por una red de áreas en forma de cúpula, representativas de las zonas hematopoyéticas (HZ) previamente reportadas para encerrar progenitores hematopoyéticos derivados de células madre embrionarias humanas.
NOTA: La presencia de las estructuras en forma de cúpula indica un proceso exitoso incluso en ausencia de centros oscuros. La incapacidad de producir HPCs puede deberse a la mala calidad de OP9/DLL1, a la calidad del lote de FBS, a la confluencia de los grupos de iPSC sembrados en OP9/DLL1 (350-600 grupos es óptimo) y/o a variaciones en la potencia de las líneas de iPSC para producir precursores hematopoyéticos.
- Aspire los medios gastados y lave 1 vez con 5 mL de solución salina equilibrada de Hanks, sin rojo de fenol, modificada con calcio y magnesio (HBSS).
- Aspirar HBSS y añadir 250 μL de 5000 Unidades/mL de colagenasa IV en 10 mL de HBSS. Incubar a 37 °C durante 45 min. Aspire HBSS con colagenasa IV y lávese una vez con 5 mL de PBS.
- Aspire PBS y agregue 5 mL de tripsina-EDTA al 0,25%. Incubar a 37 °C durante 20 min. A continuación, añada 4 ml de medio OP9 y disocie la capa de células mediante pipeteo para crear una suspensión de una sola célula.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL a través de un filtro celular de 100 μm. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 10 mL de medio OP9.
- Suspensión celular en placa en una nueva placa de Petri de cultivo celular gelatinizada de 10 cm (ver pasos 3.1.1 y 3.1.2). Incubar a 37 °C durante 45 min. A continuación, recoja las células no adherentes mediante un pipeteo suave.
- Transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo cónico de 50 mL a través de un filtro de células de 100 μm. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de medio de diferenciación [medio OP9 con 5 ng/mL de factor de células madre humanas (hSCF), 5 ng/mL de ligando Flt3 humano (hFLT3L) y 5 ng/mL de interleucina humana 7 (hIL-7)].
- Coloque la suspensión de la célula en una nueva placa confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- El día 16, paso de las celdas.
- Separe mecánicamente las células no adherentes mediante un pipeteo suave y filtre a través de un filtro de células de 100 μm. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en un medio de diferenciación de 10 mL.
- Coloque la suspensión de la célula en una nueva placa confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- A partir de entonces, continúe pasando las células no adherentes cada 5-7 días repitiendo el paso 3.8.
- En el día 35, enriquezca la población CD4+CD8+ doble positivo (DP) y estimule la producción de linfocitos T CD8αβ+ monopositivos (SP) (Figura 2).
- Separe mecánicamente las células no adherentes pipeteando suavemente y filtrando a través de un filtro de células de 100 μm para eliminar los grumos. Enriquezca la población de células CD4+ mediante el aislamiento magnético de perlas CD4 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
nota: La razón para usar perlas magnéticas CD4 es eliminar las células CD4-CD8- doble negativo (DN) del cultivo, ya que se ha demostrado que causan la muerte directa de las células CD4 + CD8+ DP después de la estimulación.
- Cuente las células vivas enriquecidas con CD4 utilizando un hemocitómetro Neubauer y un colorante azul de tripán. Suspender en medio OP9 a una concentración total de 0,5 x 106 células/mL. Alícuota 1 mL de la suspensión celular (0,5 x 106 células) en cada pocillo de un cultivo de tejidos, fondo plano, 24 placas sanas de OP9/DLL1 confluente.
- Añadir 100 UI de interleucina humana 2 (hIL-2), 5 ng/mL de hIL-7, 500 ng/mL de anticuerpo anti-CD3 humano y 2 μg/mL de anticuerpo anti-CD28 humano, luego cultivar a 37 °C.
