Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de placas alimentadoras de células gliales (2 semanas antes del día de cultivo)
- Disecciona la corteza de un cerebro de ratón postnatal de 1 día de edad y despega las meninges.
- Pica el tejido de la corteza lo más finamente posible con unas tijeras limpias en una placa de Petri limpia en un banco limpio.
- Transfiera el tejido picado a 12 mL de HBSS y agregue 1,5 mL de tripsina al 2,5% y DNasa al 1% (peso/vol). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 15 min, balancear cada 5 min. El tejido bien digerido se vuelve pegajoso y forma un gran racimo. Triturar de 10 a 15 veces con una pipeta de 10 ml para descomponer el tejido y mejorar la digestión.
- Triture el tejido bien digerido 10-15 veces con una pipeta de 5 ml hasta que la mayoría de los trozos desaparezcan y el medio se vuelva turbio. Pase a través de un colador de células para eliminar los trozos restantes y agregue 15 mL de medio glia (medio esencial mínimo (MEM) suplementado con glucosa (0.6% en peso/vol), 10% (vol/vol) de suero de caballo y penicilina-estreptomicina (1x) para detener la digestión.
- Centrifugar las células a 120 x g durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular con glia fresca, medio y semilla en placas de cultivo celular (alrededor de 105 células/cm2 ).
- Reemplace el medio con medio glial fresco al día siguiente para eliminar las células no adheridas.
- Alimente los platos de glía cada 3-4 días con medio de glía fresca. Golpee el matraz de 5 a 10 veces con una mano para desalojar las células sueltas antes de cambiar el medio.
- Después de 10 días de cultivo, las células gliales deben ser casi confluentes. Separe las células de la glía con tripsina-EDTA al 0,25% y siembre unas 105 células en una nueva placa de cultivo celular de 60 mm. Las celdas restantes podrían congelarse para su uso futuro.
- 3 días antes del día del cultivo, cambie el medio glial por medio de cultivo neuronal (medio Neurobasal-A con 1x GlutaMAX-I y 1x suplemento B27)
>2. Cultivo de neuronas del hipocampo
NOTA: Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente.
- Diseccione 6-8 hipocampos de cachorros postnatales de 1 día de edad de ratones ANK3-E22/23f/f con medio HBSS en una placa de Petri a temperatura ambiente. Pica los hipocampos con unas tijeras de disección en trozos más pequeños. Transfiera el hipocampo de la placa de Petri a un tubo de 15 ml.
- Lave el hipocampo 2 veces con 5 ml de HBSS en el tubo. Deje el hipocampo en 4,5 mL de 1x HBSS después del lavado.
- Añadir 0,5 mL de tripsina al 2,5% en 4,5 mL de HBSS e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 15 minutos. Invierta el tubo cada 5 minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un racimo. Si es necesario, extienda la digestión durante 5 minutos más.
- Lave los hipocampos con HBSS 3 veces durante 5 minutos cada uno. No use una aspiradora para quitar el HBSS. Es muy fácil quitar el hipocampo.
- Añadir 2 mL de HBSS después del lavado y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.
- Triture el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego (el diámetro de la abertura se reduce a la mitad) 10 veces. No vaya más de 10 veces, incluso si todavía quedan trozos. El cizallamiento excesivo mata las neuronas.
- Deje reposar el tubo durante 5 minutos hasta que todos los trozos se asienten hasta el fondo. Utilice suavemente una punta de pipeta de 1 ml para transferir el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a placas de recubrimiento (10 placas de5 células/60 mm). Agréguelo directamente al medio de recubrimiento preincubado y agite la placa suavemente.
- Repita los pasos 2.6-2.7 con los fragmentos restantes hasta que la mayoría de los fragmentos hayan desaparecido.
- 2-4 horas después de la siembra, revise las placas de siembra con un microscopio óptico. La mayoría de las neuronas deberían haberse adherido al cubreobjetos. Las celdas adjuntas son redondas y brillantes. Voltee los cubreobjetos con una pinza de punta fina a las placas alimentadoras de células gliales con medio de cultivo neuronal preacondicionado con el lado de los puntos de cera hacia abajo.
- Las neuronas pueden crecer en las placas alimentadoras de células gliales hasta por 1 mes. Alimente las neuronas cada 7 días con 1 mL de medio de cultivo neuronal fresco.
- Paso opcional: 1 semana después de la siembra, añadir arabinósido de citosina (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) hasta una concentración final de 5 μM para frenar la proliferación glial.
