Generación de un cultivo de neuronas primarias de baja densidad a partir de neuronas embrionarias congeladas

Resumen

Fuente: Koganezawa, N. et al., Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando stock congelado de neuronas embrionarias del hipocampo.J. Vis. Exp. (2023)

Este video muestra el método de cultivo de neuronas embrionarias criopreservadas, que implica la descongelación controlada, la dilución con un medio neurobasal y la siembra en una placa recubierta de poli-L-lisina. La incubación posterior favorece el crecimiento y el mantenimiento de las conexiones neuronales.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Recubrimiento de placas

1. Cubrir una microplaca de 96 pocillos con poli-L-lisina (1 mg/mL, diluido en tampón de borato 0,1 M [pH: 8,5]; 100 μL/pocillo) e incubar durante la noche a 37 °C.
   nota: Cubra solo los pozos que deben usarse. En los experimentos realizados aquí, se utilizan los 60 pozos del medio. El tampón de borato se prepara mezclando 50 mM de ácido bórico y 12 mM de borato en agua esterilizada.
2. Lave la placa dos veces con agua esterilizada (250 μL/pocillo).
3. Lavar la placa una vez con medio de cultivo fresco sin suplementos (250 μL/pocillo).
4. Seque la placa en un banco limpio durante 20 minutos.
5. Envuelva la placa con papel de aluminio y manténgala a 4 °C hasta su uso (válido durante 1 mes).

>2. Siembra de células

1. Añadir 50 μL/pocillo del medio de cultivo a la placa recubierta y mantenerla en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ durante 30 min a 1 h. Llene los pocillos periféricos con agua esterilizada (200 μL/pocillo).
   nota: El medio de cultivo se prepara añadiendo 50 veces B-27, 400 veces Glutamax y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina al medio neurobasal (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
2. Retire la neurona criovial del tanque de nitrógeno líquido. Las neuronas utilizadas aquí fueron neuronas criopreservadas con dimetilsulfóxido (DMSO-criopreservadas).
3. Sumerja el criovial en un bloque térmico a 37 °C durante un máximo de 3 minutos y descongele parcialmente el contenido. No caliente el criovial durante demasiado tiempo. Transfiera el contenido a un tubo de 50 ml tan pronto como se descongele.
4. Transfiera lentamente el contenido criovial de las neuronas a un tubo estéril de 50 mL gota a gota (50 μL/s) utilizando una pipeta de 1 mL con una punta de poro ancho.
5. Enjuague el criovial vacío con 1 mL del medio de cultivo (temperatura ambiente; RT). Transfiera este 1 mL del medio de cultivo del criovial gota a gota (50 μL/s) al tubo de 50 mL que contiene la suspensión celular.
6. Añadir 9 mL del medio de cultivo (RT) al tubo de 50 mL gota a gota (0,5 mL/s) y aumentar el volumen hasta 11 mL. No repita el pipeteo, mezcle la suspensión celular lentamente.
7. Cuente el número de células (use un contador de células o un hemocitómetro).
8. Transfiera toda la suspensión celular a un depósito y dispense la suspensión celular a la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal con puntas de poro ancho (1,0 x 10,⁴ celdas/pocillo). Para reducir la evaporación del medio de cultivo, llene los pocillos periféricos con agua esterilizada (paso 2.1).
   nota: Este estudio confirma que la evaporación del medio de cultivo es pequeña para un cultivo de 3 semanas sin intercambio de medio. La tasa de reducción del medio es de 3,6% (n = 120 pozos). Por lo tanto, el cambio de osmolalidad no será drástico durante el período de incubación de 3 semanas.
9. Incubar las neuronas durante 1-2 h en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂.
10. Sustituya el medio de cultivo por 100 μL de medio de cultivo precalentado (37 °C) por pocillo y vuelva a colocarlo en una incubadora de 37 °C con un 5% de CO₂ (no es necesario cambiar el medio durante el cultivo).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 96 pocillos	Corporación Zeon		dotado
Placa de 96 pocillos	Greiner	655986
B-27	Gibco	17504-044	2 v/v% para placas MEA; 50x para placas normales
bórax	sigma	B-9876	Concentración final 12 mM
Ácido bórico	WAKO	021-02195	Concentración final 50 mM
Albúmina sérica bovina	Millipore	12659-100G	Concentración final: 3% en PBS
GlutaMAX	Gibco	35050-061	2,5 mM para placas MEA; 400x para placas normales
En el analizador de células 2200	Cytiva		Imágenes de fluorescencia
Neurobasal	Gibco	21103-049
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	Números 15140-122	100 U/mL para placas normales
Penicilina/Estreptomicina	Nacalai Tesque	26253-84	100 μg/mL para placas MEA
Poli-L-lisina	sigma	Página 2636	Diluido en el tampón de borato (concentración final: 1 mg/mL)
Neurona del cielo	AlzMed , Inc.	ARH001	1,0 x 106 células/tubo