Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Recubrimiento de cubreobjetos de vidrio con Poly-L-lisina
- Prepare los cubreobjetos de vidrio descongelando una alícuota de 5 mL de 200 μg/mL de solución de poli-L-lisina (PLL). Diluya esta solución madre a 20 μg/mL añadiendo 45 mL de agua pura de grado de inyección. Filtre y esterilice la solución en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Etiquete este tubo como "PLL Sterile".
nota: Utilice agua almacenada a temperatura ambiente para acelerar el proceso de descongelación.
- Añada 100 cubreobjetos de vidrio estériles redondos de 12 mm a la solución estéril de PLL. Agite el tubo cada 5-10 min, durante 2-3 min, para asegurar una capa uniforme. Cubra los cubreobjetos de esta manera durante 1 h.
nota: Se prefieren los cubreobjetos de vidrio redondos de fabricación alemana (diámetro = 12 mm), ya que proporcionan una superficie de cultivo fiable y encajan fácilmente en los pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
- Después de 40 minutos de recubrimiento PLL, tome 2 hojas de papel de seda y colóquelas planas en el gabinete de flujo. Esterilizar el papel con etanol al 70%, luego aplanar para eliminar las arrugas y dejar secar.
- Después de recubrir los cubreobjetos de vidrio durante 1 h con PLL, retire el exceso de solución de PLL y agregue agua estéril de grado de inyección. Agite suavemente los cubreobjetos durante 2-3 s para permitir la eliminación del exceso de PLL. Repita este paso de enjuague 2 veces más.
- Retire el exceso de agua y luego transfiera los cubreobjetos al papel de seda estéril. Separe cuidadosamente cada cubreobjetos con pinzas curvas y déjelo secar.
nota: Los cubreobjetos que no se separan fácilmente se pueden desechar. Alternativamente, se puede agregar una pequeña cantidad de agua para ayudar a la separación.
- Una vez secos, transfiera los cubreobjetos a una placa de cultivo de 24 pocillos.
nota: Los cubreobjetos deben estar listos aproximadamente entre 30 minutos y 1 hora antes de comenzar el proceso de disección. Las placas se pueden almacenar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 hasta que se necesiten.
>2. Disociación del tejido del hipocampo y la corteza
- Preparación de soluciones de cultivo celular
- Para la disociación del tejido neural, primero se descongele una alícuota de 40 mL de tampón de cultivo celular (composición [en mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O y 25 D-glucosa, pH = 7,4). Mida 12 mL de tampón de cultivo celular en un tubo cónico de 15 mL; etiqueta como "BSA". Mida 5 mL de tampón de cultivo celular en un tubo diferente de 15 mL; etiqueta como "papaína". Incubar ambos tubos en un baño de agua durante 15 min a 37 °C.
- Filtrar-esterilizar el tampón de cultivo celular restante, etiquetarlo como "Tampón - Estéril" y almacenar a 4 °C hasta que sea necesario.
- Pesar 120 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y añadirlos al tubo etiquetado como "BSA". Pesa 7 mg de papaína y añádela al tubo etiquetado como "papaína". Regrese ambos tubos al baño de agua durante 15 min.
nota: Es útil agregar una pequeña cantidad de tampón al bote de pesaje para facilitar la transferencia del polvo de papaína.
- Una vez que todos los polvos se hayan disuelto, filtre y esterilice cada solución en un tubo cónico fresco de 15 mL. En el caso de la papaína en tubo, etiquete la solución filtrada como "papaína - Estéril". Para el tubo BSA, divida la solución estéril de BSA en 3 tubos, cada uno de los cuales contiene 4 ml de solución BSA. Etiquete cada tubo como "BSA - Estéril" y "1", "2" o "3". Regrese todos los tubos al baño de agua y continúe incubando a 37 °C hasta que sea necesario.
- Preparación para la disección de tejidos
- Tome una sola pieza de papel de filtro de 35 mm (ver Tabla de Materiales) y esterilice con etanol al 70%; deje secar en la tapa de una placa de Petri de 100 mm, en un gabinete de flujo. Coloque las tijeras, las pinzas, el bisturí y la espátula (consulte la Tabla de materiales) necesarios para la disección del hipocampo y la corteza.
- Coloque dos placas de Petri de 35 mm y una placa de Petri de 100 mm que contenga papel de filtro estéril en un lugar accesible en el centro del gabinete de flujo.
- Recolectar NexCre transgénico; Cachorros de ratón Venus Ai9 y VGAT que se van a diseccionar. Use una lámpara fluorescente con filtros de excitación y emisión apropiados (consulte la Tabla de materiales) para distinguir a las crías fluorescentes de las compañeras de camada de tipo salvaje.
- Inmediatamente antes de diseccionar animales, llene cada placa de Petri de 35 mm con tampón de cultivo celular estéril y refrigerado.
nota: Una placa de Petri es para limpiar las herramientas entre disecciones, y la otra es para recolectar el hipocampo y la corteza.
- Disección de tejidos
- Tan pronto como se vierta el tampón de cultivo celular, decapitar un ratón o una cría de rata transgénica del día 0-2 postnatal con unas tijeras grandes y afiladas y use una placa de Petri estéril de 100 mm para transferir la cabeza a la cabina de flujo. Use fórceps, tijeras y una espátula para transferir cuidadosamente el cerebro de un cachorro transgénico a papel de filtro estéril.
- Use un bisturí tipo 22 para diseccionar el cerebelo y separar los 2 hemisferios. Use una espátula pequeña para enrollar los hemisferios lateralmente. En cada hemisferio, presione suavemente hacia abajo para que la corteza entre en contacto con el papel de filtro. Mueva suavemente las regiones del mesencéfalo para revelar el hipocampo y la corteza.
nota: Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al presionar los hemisferios o las células pueden aplastarse.
- Usa un bisturí o una espátula para separar el hipocampo y la corteza de cada hemisferio. Transfiera el tejido diseccionado a una placa de Petri de 35 mm que contenga tampón de cultivo celular refrigerado.
nota: Si disecciona varios animales, almacene el tampón de cultivo celular estéril en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo. Después de cada disección, transfiera el tejido diseccionado al tampón de cultivo celular refrigerado.
- Después de una disección exitosa del tejido cortico-hipocampal, transfiera la solución estéril de papaína del baño de agua al gabinete de flujo. Utilice una pipeta Pasteur de 3 ml para transferir el hipocampo y la corteza disecados a la tapa de una placa de Petri estéril de 35 mm. Picar con un movimiento entrecruzado, utilizando la parte plana de un bisturí tipo 22, hasta que el tejido esté en trozos pequeños.
- Use una pequeña cantidad de solución de papaína para transferir el tejido picado de la tapa de la placa de Petri al tubo de papaína estéril. Regrese el tubo de papaína al baño de agua e incube el tejido a 37 °C durante 25 min.
- Durante la incubación de la papaína, prepare una solución completa de medios de fluorescencia. Descongele una alícuota de 1 mL de B27, una alícuota de 0,5 mL de Glutamax y una alícuota de 0,5 mL de Pen-Strep. Alícuota 48,5 mL de hibernación Un medio de baja fluorescencia a un tubo cónico de 50 mL. Agregue B27, Glutamax y Pen-Strep a la solución. Agite bien la solución, luego filtre-sterilice y etiquétela como "Hibernar un medio completo" (con fecha e iniciales). Incubar a 37 °C en un baño de agua.
- Después de la incubación de la papaína, transfiera el tubo de papaína y los tubos BSA estériles al gabinete de flujo. Utilice una pipeta Pasteur de 1 mL para extraer solo el tejido cortico-hipocampal del tubo de papaína en el tubo BSA 1.
nota: Tenga cuidado de minimizar la transferencia del exceso de solución de papaína.
- Disociación de las células
- Para romper los grandes grumos de tejido, triture el tejido varias veces con una pipeta Pasteur de 1 mL. A continuación, triture el tejido 7 veces con una pipeta Pasteur de punta fina. Deje reposar el tejido durante 30 s, permitiendo que los trozos más grandes de tejido se sedimenten.
- Después de 30 s, transfiera el 1 mL inferior de solución y tejido del tubo BSA 1 al tubo BSA 2. Triture el tejido en el tubo BSA 2 varias veces con una pipeta Pasteur de punta fina.
- Después de la trituración, transfiera nuevamente el 1 mL inferior de tejido y solución del tubo BSA 1, pero ahora al tubo BSA 3. Triture el tejido en el tubo BSA 3 varias veces con una pipeta Pasteur de punta fina.
- Después de la trituración, transfiera toda la solución y el tejido de los tubos 2 y 3 al tubo BSA 1. Triturar 2-3 veces más y centrifugar a 3.000 x g durante 3 min.
- Durante la centrifugación, forme un medio Neural Basal A completo (medio NBA). Aliquot 48,5 mL de medio NBA a un tubo cónico de 50 mL e incubar a 37 °C en un baño de agua. Etiqueta este tubo como "Solo NBA". Además, descongele una alícuota de 1 mL de B27, una alícuota de 0,5 mL de Glutamax y una alícuota de 0,5 mL de Pen-Strep a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante del tejido granulado y vuelva a suspender las células en 2 ml de medio completo. Utilice una pipeta P1000 para triturar el tejido hacia arriba y hacia abajo 20 veces.
nota: Tenga cuidado de no pipetear las células con demasiada fuerza. Si se aplica demasiada presión, las células pueden dañarse.
- Utilice una pipeta Pasteur de 1 mL para filtrar la suspensión celular a través de un tamiz celular de 30 μm en un tubo de muestra de poliestireno.
nota: Si la suspensión celular no pasa inmediatamente a través del tamiz celular, puede ser necesario presionar la parte superior del tamiz con un guante estéril para iniciar el flujo. Este importante paso evita la obstrucción del clasificador de células.
- Para recolectar neuronas después de la clasificación, prepare los tubos de recolección pipeteando 300 μL de medios completos hasta el número requerido de tubos de polipropileno.
- La suspensión de celdas ya está lista para ser llevada al clasificador de celdas para su clasificación. Tome la suspensión celular, los tubos de recolección adicionales y los medios completos de repuesto en caso de que se requiera la dilución de la muestra.
>3. Clasificación celular de neuronas GABAérgicas o glutamatérgicas purificadas
NOTA: Para minimizar la posibilidad de contaminación bacteriana durante la clasificación, enjuague el tubo de muestra del clasificador con etanol al 70% durante al menos 5 minutos antes de la clasificación. Los parámetros de clasificación detallados varían entre los instrumentos, las consideraciones fundamentales son las siguientes.
- Durante la primera clasificación de células, establezca los niveles de fluorescencia de fondo de las células no marcadas clasificando y comparando las células de un animal de tipo salvaje.
- Para cada tipo de célula fluorescente que se va a clasificar, elija los filtros de excitación y emisión adecuados. Excite las proteínas Venus y TdTomato utilizando longitudes de onda de excitación de 488 nm o 531 nm, respectivamente. Detecte la luz emitida a través de los conjuntos de filtros de emisión 530/40 y 575/30, respectivamente.
- Añada tubos de recogida de polipropileno, que contengan 300 μL de medios completos, al clasificador de células para la recogida de células.
- Para obtener una alta pureza, clasifique las celdas fluorescentes marcadas con colores brillantes (consulte la Figura 1B para ver ejemplos de diagramas de puntos de celdas ordenadas).
- Después de la clasificación, para obtener resultados óptimos, realice una prueba de pureza de las células clasificadas para estimar los niveles de pureza. Tenga en cuenta que la tasa de recuperación típica de las células después de la clasificación está entre el 70 y el 80%.
- Anote el número de celdas ordenadas en cada tubo de recolección. Este valor viene dado por el instrumento de clasificación de celdas.
nota: La clasificación de células se puede realizar utilizando una boquilla de 70 μm (presión del fluido de la vaina de 70 psi) o una boquilla de 100 μm (presión del fluido de la vaina de 20 psi).
>4. Cultivo de neuronas ordenadas
- Después de la clasificación de las células, transfiera las células recogidas a tubos de centrífuga de fondo redondo de 2 mL, utilizando una pipeta Pasteur de 1 mL. Centrifugar las células a 3.000 x g durante 3 min para formar un pellet de células.
nota: Para ayudar a identificar la ubicación del pellet de celda, oriente los tubos de centrífuga de fondo redondo con la bisagra de la tapa hacia afuera, lo que permite que el pellet de celda se forme en la parte posterior del tubo de centrífuga (es decir, en el mismo lado del tubo que la bisagra).
- Durante la centrifugación, agregue 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax y 0,5 mL de Pen-Strep a los 48,5 mL de medios NBA precalentados. Agite bien la solución, luego filtre, esterilice y etiquételo como "NBA complete media" (con fecha e iniciales). Regrese al baño de agua hasta que lo requiera.
- Después de la centrifugación, utilice una pipeta Pasteur de 1 mL para transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga diferente (conserve el sobrenadante en caso de que se haya alterado el gránulo de la célula). Vuelva a suspender el pellet de celdas en la cantidad requerida de medios NBA completos precalentados para lograr una densidad de celdas de 1,000 celdas/μL. Vuelva a suspender las celdas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200 o P1000.
- Para confirmar la presencia de células disociadas, observe la solución celular bajo un microscopio, utilizando una lente de objetivo de 4x o 10x. Alternativamente, pipetee una pequeña cantidad de solución celular en un cubreobjetos y verifique bajo el microscopio. Si hay un gran número de células, se puede descartar el sobrenadante del paso 4.3.
- Antes de colocar las celdas, haga vórtices a velocidad media durante 2-3 s para asegurar una suspensión uniforme de las celdas. Después del vórtice, pipetee rápidamente 10 μL de la suspensión celular en el centro de cada cubreobjetos. Después de pipetear las células, devuelva rápidamente cada placa a la incubadora (5% CO2/37 °C) e incube durante 1 h.
nota: Si agrega celdas a varias placas de 24 pocillos, asegure densidades celulares uniformes mediante el vórtice de celdas entre placas.
- Después de 1 h, alimente las celdas con 500 μL de medio NBA completo precalentado y devuélvalo a la incubadora.
nota: Al alimentar las células, es importante pipetear el medio suavemente por el costado del pocillo para evitar el desprendimiento de las células. Para experimentos cortos (<16 días), no es necesario alimentarse a la densidad anterior. Al sembrar una mayor densidad de celdas, es posible que se requieran intervalos de alimentación más frecuentes.
