Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias en cultivos monocapa sin suero

Resumen

Fuente: Wongpaiboonwattana, W., et al. Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en cultivo monocapa sin suero. J. Vis. Exp.(2015)

El video muestra un protocolo que utiliza medios sin suero para generar progenitores neuronales a partir de células madre embrionarias de ratón. La concentración deseada de células madre embrionarias, suspendidas en medios sin suero, se coloca en cubreobjetos recubiertos de gelatina. Con una densidad celular óptima, las células producen factores de señalización autocrinos que, junto con los factores inductores de la diferenciación neuronal en el medio sin suero, desencadenan la diferenciación de las células madre embrionarias en progenitores neuronales.

Protocolo

1. Preparación de medios

NOTA: El protocolo se basa en el uso de una mezcla de dos medios separados: DMEM/F12 suplementado con un suplemento de N2 modificado y Neurobasal suplementado con un suplemento de B27, normalmente en una proporción de 1:1.

1. Prepare el suplemento de N2 modificado mezclando los componentes en un tubo de 15 ml. No haga vórtice ni filtre esto; Mezcle invirtiendo el tubo hasta que la solución esté clara.
   1. Comience pipeteando 7,2 ml de DMEM/F12, luego agregue 1 ml de insulina de 25 mg/ml (compuesta por 0,01 M HCl) y mezcle bien invirtiendo el tubo. Se necesitan un par de minutos hasta que la solución esté clara.
   2. Añadir 1 ml de 100 mg/ml de apotransferrina (compuesta en agua), 33 μl de progesternona de 0,6 mg/ml (compuesta por etanol), 100 μl de 160 mg/ml (1 M) de putrescina (compuesta por agua), 10 μl de selenito de sodio 3 mM (compuesta por agua) y 666 μl de albúmina sérica bovina al 7,5% y mezclar bien el tubo. Alícuota en 2,5 ml y almacenar a -20 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Prepara los medios de comunicación.
   1. A 250 ml de DMEM/F12 añadir 2,5 ml de N2. Mezclar bien pero no agitar ni filtrar.
   2. A 250 ml de medios Neurobasal, agregue 5 ml de suplemento de B27. Mezclar bien pero no agitar ni filtrar.
   3. Mezcle los medios de los pasos 1.2.1 y 1.2.2 en una proporción de 1:1. En algunos casos puede ser necesaria una mezcla 1:3 (complementada como la mezcla 1:1 en el paso 1.2.4).
   4. A la mezcla añadir 0,5 ml de L-glutamina (concentración final 0,2 mM) y 3,5 μl de 2-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM) y mezclar bien sin agitar. Guarde el medio a 4 °C durante un máximo de 3 semanas y evite exponerlo a la luz. Esta mezcla final se llama N2B27.
3. Prepara la solución de gelatina.
   1. Prepare una solución de gelatina al 1% en agua ultrapura y autoclave a 121 °C, 15 psi, durante 15 min. Es importante que la botella utilizada para esto esté completamente limpia de detergentes o desinfectantes, por lo que se recomienda que se use una botella nueva para esto y solo se enjuague con agua ultrapura entre usos. Alicuota la solución al 1% en alícuotas de 50 ml y mantener a 4 °C durante meses.
   2. Calentar una alícuota de gelatina al 1% en un baño de agua a 37 °C hasta que se disuelva y añadir a 500 ml de solución salina tibia tamponada con fosfato (PBS). Mezcle bien y pipetee lo suficiente como para cubrir el fondo de cada pocillo o placa. Deje que la gelatina cubra la superficie durante al menos 30 minutos.

>2. Enchapado de las células

NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a las ESC de ratón cultivadas en suero al 10% con factor inhibidor de la leucemia (LIF), reemplazo de suero con LIF o medios sin suero con LIF y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) o inhibidores de MEK y GSK3 (medios 2i) con o sin LIF. Sin embargo, el tiempo y la eficiencia de la diferenciación pueden variar según el medio y las células. Para los experimentos que se muestran aquí, utilizamos la línea ESC de ratón 46C (con un reportero EGFP golpeado en uno de los alelos endógenos Sox1), cultivado en GMEM con un 10% de suero y LIF. Para obtener resultados óptimos, es importante que las células se disocien y se vuelvan a colocar en el medio N2B27; El simple cambio de medio de GMEM/suero/LIF a N2B27 siempre da como resultado una eficiencia de diferenciación reducida en comparación con el replateado de las células.

1. Cultive las células en GMEM con 10% de suero, 1 mM de piruvato de sodio, 1x aminoácidos no esenciales, 0,1 M 2-mercaptoetanol y 100 unidades/ml LIF13. Para obtener un cultivo subconfluente de ESC de ratón, coloque 1 x 10⁶ células en un matraz de cultivo T25, lo que llevará de 2 a 3 días.
2. Observa las células bajo un microscopio de campo claro. Cuando las celdas estén subconfluentes y listas para pasar, enjuáguelas dos veces en PBS. Agregue 1 ml de reactivo de disociación celular y regrese a la incubadora durante 2 a 5 minutos. Aunque la tripsina y otras enzimas también se pueden usar para la disociación celular, pueden afectar negativamente la unión celular, por lo que será necesario ajustar las densidades de recubrimiento.
3. Una vez que las células comiencen a levantarse de la placa, golpee el recipiente para desalojarlas en una suspensión de una sola célula. Recoja las células en 10 ml de medio y reactivo de disociación celular y pipetee en un tubo de centrífuga de 15 ml.
4. Gire las celdas a 300 x g durante 3 min en RT.
5. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de N2B27 precalentado pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces. Al pipetear la suspensión, pipetea contra el costado del tubo para evitar crear burbujas. Cuente las células con un contador de células automatizado o un hemocitómetro y registre la concentración.
6. Prepare una suspensión de celdas que contenga el número deseado de celdas por unidad de volumen que se recubrirá por pocillo en N2B27 precalentado. Una densidad de 10.500 células por^cm2 en una placa de 6 pocillos (es decir, 1 x 10⁵ células por pocillo de una placa de 6 pocillos) es óptima. Consulte la Tabla 1 para conocer el número sugerido de células por^cm2 y los volúmenes de los medios de siembra para varios recipientes de cultivo celular.
7. Aspire la gelatina del recipiente de cultivo y coloque la suspensión celular en placa de acuerdo con la densidad y el volumen sugeridos en la Tabla 1. No agites las placas, ya que esto concentrará las células en el centro. Colocar los cultivos en una incubadora húmeda a 37 °C, 5% CO₂.
8. Cambie los medios cada 1 o 2 días reemplazando todos los medios con N2B27 nuevo. Pipetear suavemente, ya que el lavado de las células puede afectar la densidad y disminuir la eficiencia de la diferenciación en los días siguientes. Cuando la viabilidad inicial después de la siembra sea pobre, coloque las células en una mezcla 1:3 de los medios suplementados con N2 y B27 y cámbiela a N2B27 después de los dos primeros días. Las células comenzarán a diferenciarse y deben mostrar la expresión de Sox1 (visible por la fluorescencia verde del reportero en la línea celular 46C utilizada aquí) dentro de 4 a 6 días.

Tabla 1. Densidades de recubrimiento y volúmenes de medios sugeridos para diferentes tamaños de recipientes. Las densidades de siembra en esta tabla se determinaron utilizando la línea celular 46C. Para obtener resultados óptimos, es posible que sea necesario ajustar la densidad de recubrimiento de cada línea individual.

plataforma	Rango de densidad efectiva (células/cm2)	Rango del número de celda a la placa	Volumen de medio inicial sugerido (μl)	Volumen de medio sugerido después del día 1 (μl)
Placa de 6 pocillos	10.500 - 36.500	99.750 - 346.750	1.000	2.000
Placa de 24 pocillos	15.600 - 46.800	29.640 - 88.920	500	1.000
Placa de 96 pocillos	103.500 - 260.000	33.120 - 83.200	100	200

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino	Tecnologías de la Vida	10270-106
DMEM/F12	Tecnologías de la Vida	11320-074
Medio neurobasal	Tecnologías de la Vida	21103-049
Reactivo de disociación celular StemPro Accutase	Tecnologías de la Vida	A11105-01
Suplemento B-27, sin suero	Tecnologías de la Vida	17504-044
insulina	sigma	I6634	Reconstituir con HCl 0,01M estéril
Apo-transferrina	sigma	T1147	Reconstituir con agua estéril
progesterona	sigma	P8783	Reconstituir con etanol
putrescina	sigma	P5780	Reconstituir con agua estéril
Selenito de sodio	sigma	S5261	Reconstituir con agua estéril
Fracción V de albúmina bovina	Tecnologías de la Vida	15260-037
L-Glutamina	Tecnologías de la Vida	25030-081	Asegúrese de que esté completamente disuelto antes de usarlo, ya que la glutamina generalmente se sedimenta
gelatina	sigma	G1890
Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Termo Científico	140675
Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Termo Científico	142475
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Termo Científico	167008
GMEM (en inglés)	Tecnologías de la Vida	11710-035
Suero fetal bovino	Tecnologías de la Vida	10270-106
MEM Solución de aminoácidos no esenciales	Tecnologías de la Vida	11140-050
Piruvato de sodio	Tecnologías de la Vida	11360-070
2-mercaptoetanol	sigma	M7522
Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2	Termo Científico	156367