Diferenciación de células madre neuronales humanas en cultivo 3D utilizando un andamio poroso

Resumen

Fuente: Stevanato, L. et al., Diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en cultivos tridimensionales, análisis de microARN y genes diana putativos. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el desarrollo y la diferenciación de las células madre neurales humanas dentro de un andamio tridimensional. Un recubrimiento de laminina en el andamio promueve la unión celular, mientras que un medio neural libre de factor de crecimiento induce la diferenciación celular en células progenitoras neurales, que extienden sus procesos dentro de una arquitectura porosa en múltiples direcciones, formando un cultivo tridimensional

Protocolo

>1. Diferenciación HNSC en la cultura tridimensional (3D)

NOTA: Aislar y derivar células madre neurales humanas (hNSCs) a partir de un tejido éticamente aprobado descrito en una publicación anterior. Por favor, siga las pautas éticas e institucionales al seguir este procedimiento.

1. Cultivo 3D con placa de 12 pocillos
   1. Utilice una técnica aséptica durante todo el procedimiento. En una cabina de seguridad biológica, rehidrate los andamios añadiendo 2 ml/pocillo de etanol al 70% preparado con agua para riego (WFIr). Evite tocar los andamios dispensando el etanol al 70% por la pared de cada pozo.
   2. Aspirar cuidadosamente el etanol al 70% y lavar inmediatamente los andamios con 2 ml/pocillo de Dulbecco Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) durante 1 min. Repita el procedimiento de lavado dos veces. Aspire cuidadosamente el DMEM: F12 después del lavado final.
   3. Recubrimiento de andamios añadiendo 2 ml/pocillo de laminina (10 μg/ml) en DMEM: F12. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante un mínimo de 2 horas. Lave la placa con DMEM tibio: F12.
   4. Siembre cada andamio con aproximadamente 500.000 hNSCs en un volumen de 150 μl de RMM+factores de crecimiento (GFs).
   5. Incubar la placa durante 3 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 para permitir que las células se asienten en los andamios.
   6. Agregue 3,5 ml de RMM a cada pocillo, teniendo cuidado de no desalojar las células de los andamios.
   7. Incube la placa durante 7 días; reemplace el medio RMM (3,5 ml/pocillo) después de 1 día (primera alimentación) y nuevamente después de 2-3 días desde la primera alimentación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM:F12	Invitrogen	21331-020	Para la preparación del medio RMM
Solución de albúmina humana	Cuidado de la salud de Baxter limitado	1501052	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 0,03%
Transferrina Recombinante Humana	sigma	T8158	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 5 μg/ml
Putrescina DiHCl	sigma	P5780	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 16,2 μg/ml
Insulina recombinante humana	sigma	I9278	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 5 μg/ml
progesterona	sigma	P6149	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 60 ng/ml
L-Glutamina	Invitrogen	25030-24	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 2 mM
Selenito de sodio	sigma	S9133	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	Se debe añadir al medio RMM, utilizado a una concentración final de 10 ng/ml
FEAG	Peprotech	AF-100-188	Se debe añadir al medio RMM, utilizado a una concentración final de 20 ng/ml
4-OHT	sigma	H7904	Se añade al medio RMM, utilizado a una concentración final de 100 nM
Laminina	AMS Biotech	3400-010-10
Agua para riego	Baxter Cuidado de la Salud	UKF7114
Placa Alvetex de 12 pocillos	Reinisterate Ltd	AVP002
etanol	Merck	1.00986.1000