Generación de neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Fuente: Wu, H. F., et al. Diferenciación eficiente de neuronas simpáticas postganglionares utilizando células madre pluripotentes humanas en condiciones de cultivo sin alimentador y químicamente definidas. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un método in vitro para generar neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Las hPSCs se diferencian en células de cresta neural (NCCs) en un soporte de matriz de membrana basal utilizando un medio de diferenciación. A continuación, las NCC se disocian y se forman en esferoides utilizando otro medio de diferenciación. Finalmente, los esferoides se transforman en neuronas simpáticas postganglionares utilizando un medio de neurona simpática.

Protocolo

1. Configuración para el recubrimiento de platos, la preparación de medios y el mantenimiento de hPSC

1. Recubrimiento de platos
   1. Recubrimiento de vitronectina (VTN)
      1. Coloque los viales de VTN en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongelen por completo, luego mezcle bien.
      2. Para una placa de Petri de 100 mm, mezcle 7 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x con 0,5 mg/mL de VTN, agregue la solución de VTN a la placa e incube a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   2. Recubrimiento de matriz de membrana basal
      1. Descongele viales de matriz de membrana basal (ver Tabla de Materiales) en hielo a 4 °C durante la noche.
      2. Para un pocillo de una placa de 6 pocillos, mezcle 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) con 20 μL de matriz de membrana basal 100x, agregue la solución de matriz de membrana basal al plato, envuelva el plato con una película de parafina y almacene en un recipiente limpio a 4 °C durante la noche. Trabaja lo más rápido posible. Los platos recubiertos se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
   3. Recubrimiento de poliornitina (PO)/laminina (LM)/fibronectina (FN)
      1. El primer día, para un pocillo de una placa de 24 pocillos, mezcle 15 μg/mL de PO con 1 mL de PBS 1x, incube a 37 °C, 5% de CO₂ durante la noche. Descongele tanto LM como FN a -20 °C durante la noche y almacene a 4 °C hasta que estén completamente descongelados.
      2. Al segundo día, aspirar la solución de PO, lavar los pocillos 2 veces con 1x PBS, añadir 1 mL de 1x PBS que contenga 2 μg/mL de LM y 2 μg/mL de FN e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante la noche. En este punto, la placa con la solución LM/FN se puede mantener en la incubadora durante meses, siempre y cuando no se seque. Agregue más 1x PBS para evitar que el plato se seque.
2. Preparación de los medios
   1. Prepare el medio Essential 8 (E8) descongelando un frasco de suplemento de E8 a 4 °C durante la noche. Mezcle el suplemento con 500 mL de medio E8 y antibióticos si es necesario.
      nota: La solución E8 de trabajo debe agotarse en 2 semanas.
   2. Prepare el medio de congelación hPSC mezclando 90 mL de medio E8 completo con 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para un volumen total de 100 mL. Filtro esterilizante.
   3. Prepare el medio de diferenciación del día 0 al día 1 mezclando 100 mL de medio esencial 6 (E6) con 10 μM de SB431542, 1 ng/mL de proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 y 10 μM Y27632 para un volumen total de 100 mL.
   4. Prepare el medio de diferenciación del día 2 al día 10 mezclando 100 mL de medio E6 con 10 μM de SB y 0,75 μM CHIR99021 para un volumen total de 100 mL.
   5. Prepare el medio esferoide del día 10 al día 14 mezclando el medio neurobasal con 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 3 μM de CHIR99021 y 10 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2) para un volumen total de 100 mL.
   6. Prepare el medio del día 14 al día 28 para el mantenimiento a largo plazo del esferoide añadiendo 0,5 μM de ácido retinoico (AR) fresco al medio esferoide del día 10 al día 14 para cada alimentación
      nota: Mantenga siempre el RA a -80 °C.
   7. Prepare el medio de maduración SymN mezclando medio neurobasal con 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 25 ng/mL de factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), 25 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), 25 ng/mL de factor de crecimiento nervioso (NGF), 200 μM de ácido ascórbico y 0,2 mM de dibutiril monofosfato de adenosina cíclica (dbcAMP) para un volumen total de 100 mL. La solución debe usarse dentro de las 2 semanas. Antes de cada alimentación, añadir 0,125 μM de RA fresco. Esta solución se utiliza a partir del día 14 (opción 1) o el día 28 (opción 2).
   8. Prepare el tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) mezclando DMEM con 2% de FBS, 2 mM de L-glutamato y antibióticos si es necesario para un volumen total de 100 mL.
3. Mantenimiento de hPSC
   1. Descongelación y mantenimiento de hPSC
      1. Prepare un plato de 100 mm recubierto de VTN.
      2. Para descongelar un vial de hPSC directamente a partir de nitrógeno líquido, coloque el vial en un baño de agua a 37 °C, balanceando cuidadosamente el tubo en el agua hasta que se descongele. Transfiera las hPSC descongeladas a un tubo de 15 mL que contenga 10 mL de 1x PBS y centrifugue a 200 x g durante 4 min.
      3. Deseche el sobrenadante y agregue 1 mL de medio E8 al tubo. Pipetee varias veces para resuspender completamente el pellet y luego agregue otros 9 mL de medio E8 para alcanzar 10 mL en total.
      4. Aspire la solución VTN de la antena de 100 mm.
      5. Transfiera las hPSC a un plato de 100 mm, agite suavemente (arriba-abajo e izquierda-derecha, no en círculos) para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente en el plato
      6. Incubar a 37 °C, con 5% de CO₂.
      7. Al día siguiente, aspire todo el medio y alimente con 10 mL de E8.
      8. Aliméntelo de esta manera todos los días durante los próximos 3 a 4 días y luego prepárese para dividir.
   2. División de hPSCs
      NOTA: Las hPSC en el punto de división deben tener una confluente del 80 % al 90 %. Se deben observar grandes colonias con bordes lisos y brillantes. Sin embargo, se debe evitar el contacto entre cada colonia (Figura 1B, día 0 y Figura 4B).
      1. Prepare platos de 100 mm recubiertos de VTN según sea necesario.
      2. Aspire el E8 y lave el plato que debe dividirse 1x con 1x PBS.
      3. Aspire el 1x PBS y agregue 4 mL de EDTA 0.25 M. Incubar durante 2 min a 37 °C, 5% CO₂.
         nota: Las hPSCs deben dividirse/replantarse como pequeñas colonias. No tratar con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante más de 2 minutos para evitar la separación en células individuales. Las células deben estar aún adheridas a la superficie del plato después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspire el EDTA, separe las colonias pipeteando fuertemente 10 mL de medio E8 en la superficie de la placa y recoja todo el medio y las células en un tubo de 15 mL.
      5. Con hPSCs con una confluencia del 80%-90%, divida las colonias en 1:15-1:20. Por ejemplo, para dividir las hPSC en 1:20 en un plato de 100 mm, tome 500 μL de solución E8/hPSC y mezcle con 9,5 mL de medio E8 fresco.
      6. Placas hPSC en placas de 100 mm recubiertas de VTN.
         nota: Se aconseja establecer la relación de división ideal para cada investigador y línea celular de forma independiente.
   3. Congelación de hPSC
      1. Para una placa de 100 mm de hPSC lista para ser partida, prepare tres crioviales y 3,5 mL de medio de congelación.
         NOTA: Los medios y viales deben mantenerse a 4 °C o en hielo hasta su uso.
      2. Aspire E8 y lave el plato 2 veces con 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS y añadir 4 mL de EDTA 0,25 M, incubar durante 2 min a 37 °C, en 5% CO₂,
         NOTA: las hPSC deben congelarse como pequeñas colonias en el momento en que se dividirán. No trate las células con EDTA durante más de 2 minutos para evitar la separación en células individuales. Las células deben seguir adheridas a la superficie de la placa después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspire el EDTA, separe las colonias pipeteando fuertemente 10 mL de 1x PBS en la superficie de la placa y recoja todo el medio y las células en un tubo de 50 mL.
      5. Agregue 20 mL de 1x PBS y centrifugue a 200 x g durante 4 minutos para lavar el EDTA restante.
      6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mL de medio de congelación.
      7. Distribuya las hPSC de manera uniforme en los tres crioviales, de 1 ml cada uno.
      8. Almacene a -80 °C durante la noche en una caja de congelación controlada o en un sándwich de espuma de poliestireno para garantizar una caída lenta de la temperatura, y luego transfiéralo a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

>2. Siembra de hPSCs para iniciar la diferenciación (día 0)

NOTA: las hPSCs deben estar listas para la diferenciación después de ser estabilizadas (es decir, ser divididas 2-3x después de la descongelación). Asegúrese de que las colonias estén sanas, con bordes lisos y brillantes, y con una diferenciación mínima (Figura 2B).

1. Prepare platos recubiertos de matriz de membrana basal (platos de 24 pocillos o 6 pocillos) un día antes del día 0, según sea necesario. Lleva los platos a RT al comienzo de la diferenciación.
2. Haga que el día 0-1 sea un medio de diferenciación según sea necesario.
3. Aspire el E8 desde el confluente, listo para dividir hPCS, y lave el plato 2 veces con 1x PBS.
4. Añadir 7 mL de EDTA 0,25 M por plato de 100 mm, incubar a 37 °C, 5% CO₂, durante 15 min.
   nota: En este punto, el tratamiento con EDTA se prolonga para dispersarse en células individuales.
5. Pipetear todas las hPSC (deben estar flotando) y transferirlas a un tubo de 50 ml. Agregue la misma cantidad o más de 1x PBS como solución de EDTA para diluir el EDTA.
6. Centrifugar a 200 x g durante 4 min.
7. Deseche el sobrenadante, agregue 1 mL de medio de diferenciación del día 0-1 y pipetee para homogeneizar las células. A continuación, agregue más medio y luego mezcle para diluir la solución celular hasta una concentración ideal para contar las células.
   nota: No diluya demasiado la solución celular. Las células de una placa completa de 100 mm deben diluirse en 5 mL de medio para comenzar.
8. Cuente el número de células usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
9. Diluya la solución celular según sea necesario para alcanzar 125,000 celdas/^cm2 en un volumen final bajo (por ejemplo, 2 mL por pocillo para un plato de 6 pocillos o 500 μL por pocillo para un plato de 24 pocillos).
   nota: Un volumen bajo ayuda a que las células se adhieran más rápido.
10. Aspire toda la solución de la matriz de membrana basal de las placas revestidas y coloque la solución celular en los pocillos.
11. Incubar a 37 °C, con 5% de CO₂.

>3. Inducción de células de cresta neural (día 1 a día 10, Figura 1A)

1. El día 1, alimente las células con el medio de diferenciación del día 0-1 (3 mL por pocillo para placas de 6 pocillos y 1 mL por pocillo para placas de 24 pocillos).
2. El día 2, alimente las células con el medio de diferenciación del día 2 al día 10 (3 mL por pocillo para platos de 6 pocillos y 1 mL por pocillo para platos de 24 pocillos).
3. A partir de ahora, las celdas deben alimentarse cada dos días hasta el día 10 (es decir, el siguiente día de alimentación será el día 4)
   nota: A partir del día 6, se deben detectar las crestas NC (Figura 1B). Para comprobar si se está produciendo la diferenciación, se aconseja llevar a cabo un cultivo de diferenciación paralelo en pocillos más pequeños (es decir, 24 pocillos), que se pueden teñir para SOX10/AP2a y utilizar para la expresión de genes marcadores a lo largo del tiempo de diferenciación (Figura 1B, C).
4. Si ordena celdas, vaya a la sección 4. De lo contrario, proceda a la sección 5.

>4. Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para el marcador de cresta neural CD49D y agregación de células NC en esferoides

NOTA: Para la clasificación FACS, las muestras deben mantenerse en hielo y no exponerse a la luz después de la tinción hasta la clasificación.

1. Prepare el búfer FACS si las celdas están ordenadas.
2. Prepare el medio esferoide del día 10 al 14.
3. El día 10, retire el medio y lave 1 vez con 1 PBS.
4. Añada la solución de disociación (véase la Tabla de Materiales) a 2 mL por pocillo para una placa de 6 pocillos o 1 mL por pocillo para una placa de 24 pocillos, e incube a 37 °C, 5% de CO₂ durante 20 min.
5. Pipetear todas las hPSC y transferirlas a un tubo de 50 ml.
6. Llene el resto del tubo con tampón FACS y centrifuga a 200 x g durante 4 min.
   nota: Cada tubo de 50 mL puede contener hasta 20 mL o menos de solución celular. El volumen del tampón FACS debe ser lo suficientemente alto como para neutralizar la solución de disociación.
7. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células con la cantidad adecuada de tampón FACS (~2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de células.
8. Prepare los siguientes ejemplos.
   1. Muestra 1 (control sin teñir): 1 x 10⁶ células en 400 μL de tampón FACS. Filtre las células a través de un tapón colador de 20 μm y mantenga el tubo en hielo.
   2. Muestra 2 (solo control DAPI): 1 x 10⁶ células en 400 μL de tampón FACS que contiene 0,5 ug/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Filtre las células a través de un tubo FACS con una tapa de colador y mantenga el tubo en hielo.
   3. Muestra 3 (marcada con CD49D): Suspender el resto de las células con tampón FACS que contenga ficoeritrina/cianina 7 (PE/Cy7) anticuerpo CD49D conjugado (5 μL por 1 x 106 células por 100 μL de tampón FACS) en un tubo de 15 mL e incubar en hielo durante 20 min.
9. Llene los tubos con tampón FACS y centrifugue a 200 x g durante 4 min.
10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada 5–10 x 10⁶ células en 1 mL de tampón FACS que contenga 0,5 ug/mL de DAPI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
11. Filtre las células a través del tubo FACS con la tapa del filtro y mantenga el tubo en hielo.
12. Prepare los tubos de recolección de FACS que contengan 2 mL de tampón FACS.
13. Clasifique la máquina FACS con láseres que pueden detectar DAPI y PE-Cy7 para aislar la población CD49D⁺.
14. Después de ordenar, cuente las celdas ordenadas.
15. Centrifugar todas las células clasificadas y volver a suspender en el día 10-14 en medio esferoide hasta una concentración final de 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de medio.
16. Placa de 0,5 x 10⁶ celdas por pocillo en placas de 24 pocillos de fijación ultrabaja.
17. Incubar las células a 37 °C, en 5% de CO₂.

>5. Agregación de células NC en esferoides

1. Si no utiliza FACS para aislar las células NC y, en su lugar, las agrega directamente en esferoides, prepare primero las células como se describe en los pasos 4.2 a 4.5.
2. Llene el resto del tubo con 1x PBS y centrifugue a 200 x g durante 4 min.
3. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células con una cantidad adecuada de medio esferoide del día 10 a 14 (por ejemplo, ~ 2 ml de medio por pocillo para una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de células.
4. Diluya las células en el medio esferoide del día 10-14 a 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de medio.
5. Placa de 500 μL de la suspensión de la celda por pocillo en placas de 24 pocillos de fijación ultrabaja.
6. Incubar las células a 37 °C, en 5% de CO₂.

>6. Mantenimiento del esferoide NC e inducción del progenitor simpático (día 10 al día 14, Figura 3A)

1. Opción 1: Cultivo mínimo de esferoides
   1. El día 11, agregue 500 μL de medio esferoide del día 10-14 a los esferoides NC sin aspirar el medio existente desde el día 10. Incubar a 37 °C, con 5% de CO₂.
   2. En el día 12, incline la placa para acumular los esferoides NC en un lado de los pocillos. Aspire y deseche cuidadosamente la mayor cantidad posible de medio, y aliméntelo con 1 mL de medio esferoide del día 10 a 14.
   3. Siga alimentando las células todos los días hasta el día 14.
   4. Opcional: Si los esferoides se agregan y generan una gran agrupación, use una pipeta para romper las agrupaciones de esferoides. Esto también garantiza que los esferoides individuales no crezcan demasiado.
      nota: El rango ideal de tamaño de esferoide debe ser de alrededor de 100-500 μm. Dentro de ese rango, el tamaño de los esferoides individuales no es crítico. Sin embargo, la morfología, como unos bordes lisos y claros (Figura 2 y Figura 4) es importante para un mayor éxito. En el día 14, cada placa de 24 pocillos contiene idealmente alrededor de 50 a 60 esferoides de diferentes tamaños dentro del rango de tamaño mencionado anteriormente.
2. Opción 2: Cultivo de esferoides expandido
   1. El día 15, para mantener los esferoides NC, aliméntelo con 1,5 mL de medio esferoide del día 10-14 que contenga 0,5 μM de AR. Incubar a 37 °C, 5% CO₂.
      nota: El AR debe añadirse fresco para cada alimentación y almacenarse siempre a -80 °C.
   2. A partir de ahora, aliméntelo cada dos días hasta el día 28 y luego continúe con la siembra de los esferoides (sección 7.1).
      nota: Los esferoides en crecimiento se dividen aproximadamente 1 vez por semana pipeteándolos con una pipeta de 1 ml para romperlos. Se dividen en una proporción aproximada de 1:2 a 1:4. Dentro del período de expansión de 2 semanas, las células deberían cuadruplicarse en número.

>7. Diferenciación y maduración de la neurona simpática (SymN) (Opción 1: después del día 14; Opción 2: después del día 28)

1. Enchapado de esferoides en platos regulares
   1. Prepare placas de 24 pocillos recubiertas de PO/LM/FM.
   2. Prepare el medio symN que contenga 0,125 μM RA (agregue fresco cada alimento) y 10 μM Y27632 (solo el día 14).
   3. En el día 14, incline la placa para acumular esferoides NC en un lado de los pozos. Aspire y deseche cuidadosamente la mayor cantidad de medio posible, y aliméntelo con 1 mL de medio symN.
   4. Retire LM/FN de las placas recubiertas.
   5. Divida y coloque cada pocillo de la placa de 24 pocillos en 4 pocillos separados de la nueva placa de 24 pocillos revestida. Cada pocillo original tendrá 1 mL, conteniendo ~50-60 esferoides. Esto produce 250 μL, que contiene aproximadamente 10-15 esferoides por cada pocillo en la nueva placa.
   6. Agregue 250 μL de medio adicional por pocillo.
      nota: Esta es una división de 1:4; Asegúrese de que los esferoides se distribuyan correctamente dentro de la solución para que la división sea relativamente uniforme. El número de esferoides no se cuenta porque el número final no afecta al éxito de la generación de symNs.
   7. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂.
   8. El día 15 (o el día 29 para la opción 2), alimente reemplazando todo el medio con 1 mL de medio symN que contenga 0,125 μM de RA. A partir de ahora, las neuronas deben alimentarse cada 2 días hasta el día 20 (o el día 35 para la opción 2).
   9. Después del día 20 (o el día 35 para la opción 2), las neuronas deben alimentarse reemplazando cuidadosamente solo la mitad del medio existente (500 μL). A partir de ahora, aliméntelo todas las semanas a menos que el medio se vuelva amarillo rápidamente.
   10. Siga alimentando semanalmente hasta el punto de tiempo deseado.
       NOTA: los simNs tienden a agregarse en estructuras similares a ganglios y son propensos a desprenderse de las placas de cultivo. Para evitar esto, se recomienda la alimentación a medias y la manipulación mínima.

Resultados

Figura 1: Inducción NC. (A) Cronología y tratamientos para la inducción de NC desde el día 0 hasta el día 10. (B) La morfología y la formación de las crestas NC se monitorearon cada 2 días mediante microscopía de campo claro. Las células en cada punto de tiempo después del día 2 se tiñeron conjuntamente para AP2A (rojo) y SOX10 (verde). Todos los cuadros de inmunoflu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo celular de 100 mm	halcón	353003
Tubos de cultivo de tejido cónico de 15 mL	VWR/Corning	89039-664
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos	halcón	353047
Placas de fijación ultrabaja de 24 pocillos	Corning	07 200 601 y 07 200 602
Incubadora de cultivo de tejidos al 5% CO2/20% O2	Tecnologías Thermo Fisher/Life	Heracell VIOS 160i
Tubos cónicos de cultivo de tejidos de 50 ml	VWR/Corning	89039-656
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Coprotagonista	3516
Accutase	Tecnologías de Células de Innovación	AT104500	Solución de disociación celular
Anticuerpo anti-AP2a	Abcam	AB108311	Huésped: Conejo; dilución 1:400
Anticuerpo anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Huésped: IgG1 de ratón; dilución 1:200
Anticuerpo anti-CD49D	BioLeyenda	304313	Huésped: IgG1 de ratón; 5 μl/millón de células en un volumen de 100 μl
Anticuerpo anti-CD49D (isotipo)	BioLeyenda	400125	Huésped: IgG1 de ratón; 5 μl/millón de células en un volumen de 100 μl
Anticuerpo anti-DAPI	sigma	D9542	Dilución 1:1000
Anticuerpo anti-DBH	Immunostar (en inglés)	22806	Huésped: Conejo; dilución 1:500
Anticuerpo anti-GFP	Abcam	AB13970	Huésped: Pollo; dilución 1:1000
Anticuerpo anti-HOXC9	Biotecnología de Santa Cruz	SC-365692	Huésped: IgG1 de ratón; dilución 1:100
Anticuerpo anti-NET1	Mab	NET17-1	Huésped: Ratón; dilución 1:1000
Anticuerpo anti-PRPH	Biotecnología de Santa Cruz	SC-377093/H0112	Huésped: IgG2a de ratón; dilución 1:200
Anticuerpo anti-SOX10	Abcam	AB50839	Huésped: Ratón; dilución 1:100
Anticuerpo anti-TH	Pel-Freez	P40101- 150	Huésped: Conejo; dilución 1:500
ácido ascórbico	sigma	A8960-5G	Concentración de stock: 100 mM
Suplemento de B27	Tecnologías Thermo Fisher/Life	12587-010	Concentración de existencias: 50x
BDNF	Sistemas de investigación y desarrollo	248-BD	Concentración de stock: 10 μg/mL
BMP4	Sistemas de investigación y desarrollo	314-BP	Concentración de stock: 6 mM
Contador de células	Tecnologías Thermo Fisher/Life	Condesa II
Portaobjetos de la cámara de recuento de células	Invitrogen	C10312
centrífuga	Eppendorf	57021 y 5424R
CHIR99021	Sistemas de investigación y desarrollo	4423	Concentración de stock: 6 mM
Crio-vial	Tecnologías Thermo Fisher/Life	375353
dbcAMP	sigma	D0627	Concentración de stock: 100 mM
DMEM	Tecnologías Thermo Fisher/Life	10829-018	Concentración de existencias: 1x
DMEM/F12	Tecnologías Thermo Fisher/Life	11330-057	Concentración de existencias: 1x
Dmso	Tecnologías Thermo Fisher/Life	BP231-100
E6 medio	gibco	A15165-01
E8 medio	gibco	A15169-01	Concentración de existencias: 1x
Suplemento E8	gibco	A15171-01	Concentración de existencias: 50x
EDTA	sigma	ED2SS	Concentración de existencias: 0,5 M
Máquina FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (para FACS)
Máquina FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (para clasificar)
Tubos FACS (tapón de filtro azul)	halcón	352235
Tubos FACS (tapón blanco)	halcón	352063
Suero fetal bovino (FBS)	Biológicos de Atlanta	S11150
GDNF (en	PeproTech	450	Concentración de stock: 10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Matriz de membrana basal; Concentración de existencias: 100x
hPSCs	Thomson et al., (1998)	WA09
hPSCs	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina humana (FN)	VWR/Corning	47743-654	Concentración de stock: 1 mg/mL
L-glutamina	Thermo Fisher/Gibco	25030-081	Concentración de stock: 200 mM
Tanque de LN	Sistemas biogénicos personalizados	V-1500AB
Laminina de ratón I (LM)	Sistemas de investigación y desarrollo	3400-010-01	Concentración de stock: 1 mg/mL
Suplemento de N2	Tecnologías Thermo Fisher/Life	17502-048	Concentración de existencias: 100x
Medio neurobasal	gibco	21103-049	Concentración de existencias: 1x
NGF (Fondo Nacional de Protección	PeproTech	450-01	Concentración de material: 25 μg/mL
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	Números 14190-136	Concentración de existencias: 1x
Hidrobromuro de poli-L-ornitina (PO)	sigma	P3655	Concentración de stock: 15 mg/mL
Primocina (antibióticos)	InvivoGen	ANTPM1	Concentración de existencias: 50 mg/mL
Máquina de qPCR	Laboratorios Bio-Rad	C1000 Táctil
Placas qPCR	Laboratorios Bio-Rad	HSP9601
FGF2 recombinante	Sistemas de investigación y desarrollo	233-FB/CF	Concentración de stock: 10 μg/mL
Ácido retinoico	sigma	R2625	Concentración de stock: 1 mM
SB431542	Tocris/Sistemas de Investigación y Desarrollo	Año 1614	Concentración de stock: 10 mM
Azul de tripano	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)	Tecnologías Thermo Fisher/Life	A14700	Concentración de stock: 0,5 mg/mL
Baño de agua	VWR/Corning	706308
Y27632	Sistemas de investigación y desarrollo	Año 1254	Concentración de stock: 10 mM