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1. Preparativos
- Prepare 10 ml de medio de disección y añada 200 μl de penicilina-estreptomicina 100x en 9,8 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12).
- Preparar la solución de L-cisteína: 10 ml de agua para el cultivo de tejidos, y añadir 120 mg de L-cisteína. Almacene la solución de L-cisteína a 4 °C durante un máximo de 2 semanas o en alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 año.
- Preparación de la solución de DNasa I: a 1 ml de agua para el cultivo de tejidos, añadir 10 mg de DNasa I. Almacene la solución de DNasa I a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
- Preparar la solución de papaína: para preparar la solución de papaína, agregue 100 μl de papaína (aproximadamente 140 unidades), 100 μl de DNasa I (1%) y 200 μl de L-cisteína (12 mg/ml) en 5 mL de DMEM/F12. Prepare la solución de papaína cada vez y esterilícela con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm antes de usar.
- Preparar la solución de lavado: para preparar 100 ml de solución de lavado, añadir 650 μl de glucosa al 45%, 500 μL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico, HEPES 1 M y 5 ml de suero fetal bovino (FBS) en 93,85 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 1x. Esterilice la solución de lavado con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm antes de usarla. Almacene la solución de lavado a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
- Preparación de la solución de insulina: para preparar 2 ml de solución de insulina, añadir una gota de 25 μl de hidróxido de sodio (NaOH) 10 N y 100 mg de insulina en 2 ml de agua para el cultivo de tejidos.
- Prepare soluciones de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF): Disuelva ambos mitógenos en DMEM/F12 a una concentración de 100 μg/ml. Conservar como alícuotas de 10 μl a -20 °C.
- Prepare los medios B-27 y N-2: almacene los suplementos de B-27 y N-2 a -20 °C como alícuotas de 500 μl y 1 ml, respectivamente.
- Preparar medio de condición de diferenciación Z: para preparar 100 ml de medio de condición de diferenciación Z, agregue 40 μl de insulina (50 mg/ml), 500 μl de B-27, 1 ml de N-2, 650 μl de glucosa al 45% y 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina en 97,81 ml de DMEM/F12. Esterilice el medio de condición de diferenciación Z con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm antes de usarlo. Almacene el medio de condición de diferenciación Z a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
- Preparación del medio de condición Z: para preparar 50 ml de medio de condición Z, añada 10 μl de EGF y 10 μl de FGF en 50 ml de medio estéril de condición de diferenciación Z (20 ng/ml). Almacene el medio de condición Z a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
- Preparación de la solución de recubrimiento para el cultivo de diferenciación: para 5 ml de solución de recubrimiento extracelular, agregue 100 μl de la solución de matriz extracelular (por ejemplo, Matrigel) en 4,9 ml de DMEM/F12. Descongelar la solución de matriz extracelular a 4 °C en hielo. Una vez descongelado, mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
>2. Disección del cerebro del pez cebra adulto
- Prepare un lecho de disección llenando una placa de Petri de 100 mm x 15 mm con bolsas de hielo en gel. A continuación, coloque la tapa en la placa de Petri e incube a -20 °C hasta que el gel se congele. Encima de la tapa, coloque un cuadrado de papel de filtro limpio y envuelva tanto el papel de filtro como la placa de Petri con una película de plástico.
- Limpie y esterilice todos los instrumentos de microdisección con etanol al 70% o caliente antes de cada uso. Coloque todos los instrumentos de disección esterilizados cerca del microscopio de disección y, justo antes de la eutanasia, coloque la cama de disección debajo del microscopio con iluminación de fibra óptica.
- Recolecta 2 peces cebra adultos para una preparación de la neurosfera de todo el cerebro; y de 3 a 4 peces cebra para generar neuroesferas a partir de regiones cerebrales disecadas.
- Eutanasiar al pez cebra adulto (8-12 meses de edad) utilizando un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. A continuación, sumerja el pez en etanol al 75% durante 5-10 segundos y colóquelo rápidamente en el lecho de disección seguido de la decapitación a nivel de las branquias con una cuchilla quirúrgica.
- Para sacrificar a los animales, administre una sobredosis (300 mg/L) de sulfonato de metano tricaína hasta que los latidos del corazón del animal se ralenticen gradualmente y la circulación se detenga, luego sumérjalo en agua helada.
- Gira la cabeza con el lado dorsal hacia abajo y, con las tijeras, haz un corte longitudinal desde el lado cortado hasta la boca. Con las pinzas, exponga la base del cráneo y extraiga todo el tejido adyacente. Corta las paredes laterales del cráneo desde el comienzo de la médula espinal hacia el tectum.
- Con las tijeras, corte y retire los nervios ópticos y luego retire ambos lados de la parte más lateral del cráneo a nivel del tectum. Gira la cabeza con el lado ventral hacia arriba. Con pinzas, despegue el resto de la parte más apical del cráneo.
- Transfiera el cerebro junto con la parte restante del cráneo a una nueva placa con el medio de disección (1.1). Limpie el tejido cerebral en el medio de disección con el mango de plástico del microcuchillo, manteniendo intactas todas las estructuras cerebrales.
- A partir de este punto, continúe el protocolo utilizando todo el cerebro del pez cebra.
- Alternativamente, adapte este protocolo a regiones específicas del cerebro para generar neuroesferas a partir de todo el cerebro del pez cebra o del telencéfalo, tectum/diencéfalo o cerebelo diseccionado con un bisturí nuevo. Utilice una línea transgénica neuronal fluorescente de pez cebra específica para diseccionar la región del cerebro de interés, de acuerdo con la Figura 1.
>3. Disociación de una sola célula del cerebro adulto
- Realice todos los trabajos posteriores en una cabina de seguridad biológica. Transfiera el tejido cerebral a un tubo de 1,5 ml que contenga 800 μl de medio de disección (preparado en el paso 1.1). Retire el medio de disección mediante pipeteo, sin tocar el tejido cerebral.
- Añadir 500 μl de solución de papaína (paso 1.4) y digerir el tejido cerebral a 37 °C durante 10 min. No incube más de 15 minutos, ya que podría disminuir la viabilidad celular.
- Después de la incubación, transfiera el tejido cerebral con 500 μl de la solución de papaína a un tubo cónico de 15 ml utilizando una punta de pipeta de 1,000 μl cortada a ~ 0.25 pulgadas del fondo. Disocie suavemente el tejido cerebral pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con la misma punta. No pipetear hacia arriba y hacia abajo más de 15 veces y no genere burbujas de aire durante este paso, ya que podría alterar la viabilidad celular.
- Incubar el tejido cerebral de nuevo a 37 °C durante 10 minutos, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo 10-13 veces con una punta regular de 1.000 μl sin cortar. No pipetear hacia arriba y hacia abajo más de 15 veces, para evitar la muerte celular.
- Detenga la digestión enzimática añadiendo 2 ml de solución de lavado (paso 1.5) y centrifugue la suspensión celular a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en la solución restante golpeando vigorosamente el tubo con un dedo y luego pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta regular de 1.000 μl. A continuación, añade 2 ml de solución de lavado.
- En esta etapa, verifique bajo el microscopio que se haya obtenido una suspensión de una sola célula. Centrifugar de nuevo la suspensión celular a 800 x g durante 5 min en RT. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet utilizando 1 ml de medio fresco en condición Z (paso 1.10).
- Tiña las células con azul de tripán y cuenta las células vivas con un hemocitómetro excluyendo las células muertas azules. Prepare una placa de 24 pocillos con 200 μl de suspensión celular y 300 μl de medio fresco en condición Z en cada pocillo. Células semilla a una densidad de ~500 células/μl. Mantenga las células cultivadas en una incubadora a 30 °C con 5% de CO2, ya que las neurosferas derivadas del cerebro del pez cebra no crecen bien a 37 °C.
>4. Generación de Neuroesferas Primarias
- Después de 1 día in vitro (DiV1), observe la suspensión de una sola célula obtenida del cerebro completo adulto bajo el microscopio y observe si se han acumulado desechos en el centro del pocillo. Elimine con cuidado cualquier residuo pipeteando aproximadamente 100 μl de medio (menos si es posible). A continuación, agregue 100 μl de medio fresco de condición Z. En este momento se deben observar suspensiones de una sola célula (Figura 2A DiV1).
- Después de 2 días in vitro (DiV2), expanda las células cultivadas. Con una pipeta de 1.000 μl con la punta cortada, recoja y transfiera 250 μl de suspensión celular de cada pocillo a un nuevo pocillo. Agregue 250 μl de medio fresco en condición Z en todos los pocillos. Antes de expandir las células cultivadas, homogeneice la suspensión muy suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo por todo el pocillo.
- Repita los pasos 4.1 y 4.2 durante los siguientes 4 días in vitro (DiV4). Un aumento progresivo en el tamaño de las neuroesferas debería ser visible en el centro y los bordes del pozo en DiV3 y DiV4 (Figura 2B y C).
nota: Las neuroesferas primarias pueden procesarse para su paso o diferenciación con el fin de evaluar la multipotencia. Alternativamente, pueden procesarse para nucleofección o lipotransfección para caracterizar el papel de genes específicos durante el proceso de diferenciación.
>5. Aprobación de las neuroesferas primarias
- Extraer 250 μl de cultivo de tejido de cada pocillo y disociar mecánicamente las neuroesferas DiV4 con una pipeta de 1 ml. No pipetee hacia arriba y hacia abajo demasiado rápido, ya que la formación de burbujas de aire puede aumentar la muerte celular.
- Cuente las células con un hemocitómetro y distribuya 800 células/μl en 250 μl de sobrenadante de cultivo primario en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Agregue 250 μl de medio de condición Z a cada pocillo.
- Después de 2 días in vitro (DiV2), expanda las células cultivadas como se informó en los pasos 4.2 y 4.3.
>6. Diferenciación de las neuroesferas primarias
- Esterilice los cubreobjetos por inmersión en etanol al 70% durante 10 min, luego seque los cubreobjetos en RT colocándolos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Agregue 300 μl de solución de recubrimiento extracelular (paso 1.11) en el centro del cubreobjetos de tal manera que pueda expandirse ampliamente y cubrir todo el cubreobjetos. A continuación, incubar a 37 °C durante 1 h (utilizando la incubadora de cultivos celulares humidificada).
- Retire la solución de recubrimiento extracelular después de la incubación y seque el cubreobjetos durante 2 horas a 37 °C.
- Extraer 250 μl de cultivo de tejidos de cada pocillo. Disocie mecánicamente todas las neuroesferas primarias DiV4 por pocillo con una pipeta de 1 ml (con punta más ancha) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Siembra suspensiones celulares de neurosfera disociadas a una densidad celular de 4 x 103 células/ml en cubreobjetos recubiertos de matriz extracelular previamente preparados (paso 6.1-6.3) y mantenlas durante al menos 30 min, a 30 °C con 5% de CO2, hasta que se adhieran al sustrato. A continuación, retire el medio de cultivo y añada rápidamente 1 ml de medio de condición de diferenciación Z fresco precalentado (paso 1.9) antes de cultivar las células durante 24 horas a 30 °C con 5% de CO2.
- Cada dos días, reemplace la mitad del medio de la condición de diferenciación Z durante el tiempo de diferenciación celular.
