>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Generación de organoides cerebrales (23 días)
- Inicio del neuroectodermo (5 días)
NOTA: Se deben tener en cuenta los siguientes puntos antes del inicio de la diferenciación. Idealmente, el método de reprogramación (lentiviral, basado en virus Sendai, episómico o microARN, etc.) para obtener iPSC humanas debería ser el mismo para todas las líneas de iPSC de pacientes y controles. Están disponibles varios kits de reprogramación e instrucciones basadas en protocolos publicados. La calidad de las líneas de iPSC humanas es la clave para lograr una diferenciación óptima. Monitorice la morfología de las colonias y las células con un microscopio y valide la pluripotencia probando la expresión de marcadores como Oct3/4, Nanog o TRA-1-60.
- Cultivo de iPSCs humanas en condiciones libres de alimentador en el medio A en un plato recubierto con matriz de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
nota: Cultive iPSCs humanas sin alimento y sin suero para mantener una condición de cultivo definida y evitar un paso adicional para la eliminación de células alimentadoras embrionarias de ratón (MEF) antes del inicio de la diferenciación. El número de paso óptimo para que las iPSC humanas comiencen a diferenciarse oscila entre el paso 15 en el momento de la reprogramación y el paso 70 en total. Al pasar, separe las colonias de hiPSC a medida que las células se agregan utilizando una solución de desprendimiento de células adecuada con bajo estrés mecánico y una pipeta serológica de 2 ml para transferir los agregados a una nueva placa. Evite la disociación a células individuales, ya que esto podría inducir diferenciación y apoptosis en la mayoría de las líneas de iPSC. Se informó que el paso a largo plazo de una sola célula podría aumentar las alteraciones genómicas en las iPSC humanas. Evite los procedimientos de desmontaje de células, que requieren un paso de centrifugación para eliminar la solución de desprendimiento, ya que esto reduce la viabilidad general de las iPSC. Analice todos los cultivos para detectar contaminaciones microbianas, en particular micoplasmas, de forma regular, ya que esto podría alterar la calidad de las iPSC y su capacidad de diferenciación.
- Cubra una placa de cultivo de tejidos de 60 mm con matriz EHS según las instrucciones del fabricante.
- Descongele una alícuota de 1 x 106 iPSC humanas. Siembre las iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm recubierta con una matriz de EHS y que contenga 5 mL de medio A (consulte la tabla de materiales). Cambie el medio diariamente y pase después de 5 a 7 días cuando las células alcancen ~80% de confluencia.
nota: Pasar las iPSCs descongeladas al 80% de confluencia utilizando métodos estándar, como el desprendimiento libre de enzimas de las colonias, al menos una vez antes de comenzar la diferenciación. En resumen, retire el medio iPSC, lave las células una vez con Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) precalentado a 37 °C y cocine las iPSC siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando el reactivo A (consulte la tabla de materiales). No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación a células individuales. Las iPSC humanas deben estar separadas y flotando como agregados, no como células individuales. A continuación, se pueden transferir a nuevas placas recubiertas de matriz EHS; por ejemplo, los agregados de iPSC de un plato de 60 mm se pueden distribuir a 4 nuevos platos de 60 mm.
b. Compruebe la presencia de micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice únicamente iPSC libres de micoplasma, ya que el micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las iPSC.
- Disociar las iPSCs (80% confluentes) y preparar una suspensión unicelular utilizando el reactivo B
- Lave las iPSC una vez con DMEM/F12 precalentado (37 °C).
- Añadir el reactivo B precalentado (por ejemplo, 1 mL en una placa de 60 mm) e incubar las iPSC durante 5 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Golpee 20 veces con la yema del dedo el costado y la parte inferior del plato para separar las iPSC. Verifique el desprendimiento de células bajo el microscopio.
- Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en el plato 5 veces con una micropipeta de 1 ml.
- Añadir 3 mL de medio A para diluir 1 mL de reactivo B y recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL.
- Gire suavemente las iPSC (500 x g) durante 4 minutos a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender el pellet de células en 1 mL de medio B y cuente el número de células con un hemocitómetro.
nota: Tenga en cuenta que debe usar solo el medio B para la resuspensión. Evite el uso del medio A, ya que contiene una concentración demasiado alta de bFGF, lo que podría inhibir la diferenciación.
- Diluir la suspensión celular a 4,5 x 105 células por mL en medio B suplementado con 10 μM de inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (Y-27632).
- Agregue 100 μL por pocillo en una placa de 96 pocillos, de fondo en V no adherente.
nota: Asegúrese de que las células estén distribuidas uniformemente en la suspensión agitando el tubo cada vez antes de extraer porciones de 100 μL. Es importante que cada pocillo contenga un número de células equivalente para obtener neuroesferas homogéneas en tamaño y forma (superficies redondas y definidas).
- Gire suavemente la placa con las células a 500 x g y temperatura ambiente durante 3 minutos e incube a 37 °C y 5% de CO2.
- Cambie el medio diariamente eliminando 50 μL y agregando 50 μL de medio B fresco en cada pocillo durante los próximos 5 días.
>2. Incrustación de neuroesferas en la matriz de EHS (4 días)
- Prepare el medio neurosphere mezclando lo siguiente: mezcla 1:1 de DMEM/F12 y medio C (v/v), suplemento 1:200 (v/v) 1, suplemento 1:100 (v/v) 2 sin (c/o) vitamina A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos no esenciales (MEM), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1,6 g/L de insulina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol.
- Recoja las neuroesferas con una micropipeta de 200 μL utilizando una punta de ~2 mm previamente cortada con tijeras estériles.
- Coloque las neuroesferas a una distancia aproximada de 5 mm entre sí sobre una película de parafina (3 x 3 cm2) en un plato vacío de 100 mm y retire con cuidado la mayor cantidad posible del medio restante.
- Agregue una gota (7 μL) de matriz EHS en cada neurosfera.
- Incubar las gotas de matriz EHS con las neuroesferas durante 15 minutos en una incubadora.
- Lave cuidadosamente las neuroesferas de la película de parafina enjuagándolas con el medio neurosphere. Para enjuagar, utilice una micropipeta de 1 mL y una nueva placa de Petri de 100 mm que contenga 10 mL de medio neurosphere.
- Incubar las neurosferas durante los próximos 4 días y añadir 2 mL de medio neurosphere fresco el día 2.
nota: Asegúrese de que los estantes de la incubadora estén planos para que las neuroesferas integradas en la matriz de EHS no se agrupen en un lado del plato.
>3. Organoides en un cultivo de suspensión rotativa (14 días)
- Prepare el medio organoide cerebral mezclando lo siguiente: mezcla 1:1 de DMEM/F12 y medio C (v/v), suplemento 1:200 (v/v) 1, suplemento 1:100 (v/v) 2 sin vitamina A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM MEM, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1,6 g/L de insulina, 0,5 μM de dorsomorfina, 5 μM SB431542, y 0,05 mM de β-mercaptoetanol.
- Agregue 100 mL de medio organoide cerebral a cada matraz giratorio a través de sus brazos laterales y colóquelos en una incubadora para precalentarlos durante al menos 20 minutos.
- Configure un programa de agitación a 25 rpm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
nota: Antes de transferir las neuroesferas integradas en la matriz de EHS a matraces giratorios, asegúrese de que todas estén separadas. Si dos o más están conectadas a través de la matriz EHS, sepárelas cortando la matriz de conexión con un bisturí.
- Transfiera cuidadosamente las neuroesferas integradas en la matriz de EHS a matraces giratorios que contengan 100 mL de medio organoide utilizando una pipeta serológica de 2 mL. Utilice los brazos laterales del matraz giratorio para transferir las neuroesferas al matraz.
- Coloque los matraces giratorios en una plataforma de agitación magnética en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2; este es el día 0 del cultivo de organoides.
- Cambie el medio una vez por semana (o más a menudo cuando haya un cambio de color) eliminando la mitad del medio y agregando la misma cantidad de medio fresco.
nota: Al sacar los matraces giratorios de la incubadora, espere de 3 a 5 minutos para que los organoides se hundan hasta el fondo del matraz. Retire el medio colocando la punta de la pipeta de vidrio (conectada a una bomba) en la superficie del líquido; Aspire el medio con cuidado a través de una abertura/brazo lateral del matraz. Estas manipulaciones deben realizarse bajo el capó laminar.