Diferenciación inducida por estimulación eléctrica de células madre neurales y progenitoras

Resumen

Fuente: Chang, H. et al., Diferenciación de células precursoras neurales inducida por campos eléctricos en dispositivos microfluídicos.J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el uso de un chip microfluídico recubierto de matriz extracelular para diferenciar células madre neurales y progenitoras o NPC a través de la estimulación eléctrica. Después de sembrarse y adherirse a la región recubierta, las NPC crecen y la aplicación de una corriente continua desencadena su diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Protocolo

1. Diseño y fabricación del chip electrotáctico (MOE) multicanal, ópticamente transparente

1. Dibuje patrones para las capas individuales de polimetacrilato de metilo (PMMA) y la cinta adhesiva de doble cara utilizando el software adecuado (Figura 1A, Tabla de materiales). Corte tanto las hojas de PMMA como la cinta adhesiva de doble cara con una máquina trazadora láser de CO₂ (Figura 1B).
   1. Encienda el trazador láser CO₂ y conéctelo a un ordenador personal. Abra el archivo de patrón diseñado con el software.
   2. Coloque las hojas de PMMA (275 mm x 400 mm) o la cinta adhesiva de doble cara (210 mm x 297 mm) en la plataforma del trazador láser (Figura 2A). Enfoque el láser en la superficie de las láminas de PMMA o en la cinta adhesiva de doble cara con la herramienta de enfoque automático.
   3. Seleccione el trazador láser como impresora y, a continuación, "imprima" el patrón utilizando el trazador láser para iniciar la ablación directa en la hoja de PMMA o en la cinta adhesiva de doble cara y obtener patrones individuales en la hoja o cinta de PMMA (Figura 2B).
2. Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno.
   nota: El dibujo del patrón de PMMA y el mecanizado directo de la lámina de PMMA se realizaron de acuerdo con un informe anterior.
3. Para unir varias capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de 1 mm (capas 1, 2 y 3) y únalas bajo una presión de 5 kg/^cm2 en un adhesivo térmico durante 30 minutos a 110 °C para formar el conjunto de canal de flujo/estimulación eléctrica (Figura 2C><). nota: Los diferentes lotes de láminas de PMMA obtenidas comercialmente tienen temperaturas de transición vítrea (Tg) ligeramente diferentes. La temperatura óptima de unión debe probarse en incrementos de 5 °C cerca de la Tg.
4. Adherir 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa 1 del conjunto de chips MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.
   nota: Los adaptadores están hechos de PMMA por moldeo por inyección. Las superficies planas en la parte inferior son para conectarse al chip MOE. Los adaptadores que llevan roscas de tornillo hembra 1/4W-28 son para conectar enchufes blancos apretados con los dedos, conectores de fondo plano o adaptadores Luer. Tenga cuidado al usar pegamento de cianoacrilato de acción rápida. Evite salpicar en los ojos.
5. Desinfecte los sustratos de PMMA de 1 mm (capas 1-3), la cinta adhesiva de doble cara (capa 4) y el PMMA de grado óptico de 3 mm (capa 5) mediante irradiación ultravioleta (UV) durante 30 minutos antes de ensamblar el chip (Figura 1A).
6. Adherir los sustratos de PMMA de 1 mm (capas 1-3) sobre el PMMA de grado óptico de 3 mm (capa 5) con la cinta de doble cara (capa 4) para completar el ensamblaje de PMMA (capas 1-5) (Figura 1A).
7. Prepare la cubierta de vidrio limpia para el ensamblaje en el chip.
   1. Llene una dilución diez veces mayor del detergente en un frasco de tinción (consulte la Tabla de materiales) y limpie el cubreobjetos con este detergente con un limpiador ultrasónico durante 15 minutos.
   2. Enjuague bien el frasco de tinte con agua corriente del grifo para eliminar todos los restos de detergente.
   3. Continúe enjuagando con agua destilada para eliminar todos los restos de agua del grifo y repita el paso 1.7.2 dos veces.
   4. Seque la cubierta de vidrio limpia soplándola con gas nitrógeno.
8. Desinfecte el ensamblaje de PMMA (capas 1-5), la cinta adhesiva de doble cara (capa 6) y el vidrio de cubierta (capa 7) utilizando irradiación UV dentro de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos antes de ensamblar el chip (Figura 1A).
9. Adhera el cubreobjetos limpio (Capa 7) al conjunto de PMMA (Capas 1-5) con la cinta adhesiva de doble cara (Capa 6) (Figura 1A).
10. Incube el chip MOE en una cámara de vacío durante la noche; utilice el conjunto del chip MOE para los procedimientos posteriores (Figura 3).

>2. Recubrimiento de poli-L-lisina (PLL) sobre el sustrato en las regiones de cultivo celular

1. Prepare el tubo de politetrafluoroetileno, el conector de fondo plano, el conector cónico, el adaptador Cone-Luer, el tapón blanco apretado con los dedos (también llamado tapón), el adaptador Luer, la jeringa Luer lock y el tapón de goma negra (Figura 4A, Tabla de materiales). Esterilizar todos los componentes anteriores en un autoclave a 121 °C durante 30 min.
2. Selle las aberturas de los adaptadores de puente de agar (Figura 1A) con los tapones blancos apretados con los dedos. Conecte el conector de fondo plano al conjunto de chip MOE a través de los adaptadores de entrada y salida del medio (Figura 4B). Conecte el adaptador cónico-Luer a las llaves de paso de 3 vías.
3. Agregue 2 mL de solución PLL al 0.01% usando una jeringa de 3 mL que se conecte a la llave de paso de 3 vías de la entrada del medio (Figura 4B-).
4. Conecte una jeringa vacía de 3 mL a la llave de paso de 3 vías de la salida del medio (Figura 4B-).
5. Rellene las regiones de cultivo celular con la solución PLL. Bombee manualmente la solución de recubrimiento hacia adelante y hacia atrás lentamente. Cierre las dos llaves de paso de 3 vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo.
6. Incubar el chip MOE a 37 °C durante la noche en una incubadora llena de una atmósfera con un 5% de_CO2.

>3. Preparación de la red de puentes salinos

1. Siguiendo el paso 2.6, abra las dos llaves de paso de 3 vías y enjuague las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento hacia adelante y hacia atrás en el canal usando las dos jeringas.
2. Extraiga 3 mL de medio completo (medio de mantenimiento de células madre que consiste en el medio de Eagle modificado de Dulbecco/la mezcla de nutrientes de Ham F-12 (DMEM/F12), suplemento de B-27 al 2%, 20 ng/mL de EGF y 20 ng/mL de bFGF) en una jeringa de 3 mL que se conecta a la llave de paso de 3 vías de la entrada del medio (Figura 4B- y Figura 4B- ).
3. Agregue 3 mL de medio completo para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Conecte una jeringa vacía de 5 mL a la llave de paso de 3 vías de la salida del medio (Figura 4B-).
4. Prepare la red de puentes salinos (Figura 5).
   1. Corte el tapón de caucho negro para producir un espacio e inserte los electrodos de plata (Ag)/cloruro de plata (AgCl) a través del tapón de caucho negro y en la jeringa Luer lock (Figura 4A).
   2. Reemplace el tapón blanco apretado con los dedos con el adaptador Luer e inyecte agarosa caliente al 3% para llenar el adaptador Luer.
      nota: Para la preparación de la agarosa caliente, disuelva 3 g de polvo de agarosa en 100 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y esterilice en un autoclave a 121 °C durante 30 min.
   3. Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer. Inyecte agarosa caliente al 3% a través del tapón de goma negra para llenar la jeringa Luer lock con la jeringa con aguja. Espere de 10 a 20 minutos para que la agarosa se enfríe y solidifique.
      nota: Para aumentar la capacidad de volumen de la agarosa, la jeringa de bloqueo Luer se monta en el adaptador Luer (Figura 4 y Figura 5). Luego, los electrodos grandes se insertan en la jeringa Luer Lock. El electrodo es capaz de proporcionar una estimulación eléctrica estable para el experimento a largo plazo.

>4. Preparación de mNPCs

1. Cultive las mNPC en el medio completo en un matraz de cultivo celular de 25T a 37 °C en una incubadora llena de atmósfera de CO₂ al 5%. Subcultive las células cada 3-4 días y realice todos los experimentos con células que hayan pasado por 3-8 pasajes desde la fuente original.
2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga las neuroesferas a 100 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y lave las neuroesferas con 1x PBS de Dulbecco (DPBS). Gira las neuroesferas a 100 × g durante 5 min.
3. Aspire el 1x DPBS y luego vuelva a suspender las neuroesferas en el medio completo. Mezclar abundante y suavemente.
4. Agregue 1 mL de la suspensión de la neurosfera usando una jeringa de 1 mL que se conecte a la llave de paso de 3 vías de la salida (Figura 4B-).

>5. Configuración del sistema microfluídico para la estimulación de pulsos de CC (Figura 6)

1. Instale el chip MOE sembrado en la celda en el calentador de óxido de indio y estaño transparente (ITO) que está sujeto en una plataforma motorizada X-Y-Z programable.
   nota: La temperatura de la superficie ITO se controla mediante un controlador proporcional-integral-derivativo y se mantiene a 37 °C. Un termopar tipo K se sujeta entre el chip y el calentador ITO para monitorear la temperatura de las regiones de cultivo celular dentro del chip. El chip MOE está instalado en una platina motorizada X-Y-Z programable y es adecuado para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo en secciones de canal individuales. La fabricación del calentador ITO y la configuración del sistema de calentamiento de cultivos celulares se han descrito anteriormente.
2. Infunda los mNPC bombeándolos manualmente en el chip MOE a través de la salida del medio. Incubar el chip MOE sembrado en la célula en el calentador ITO a 37 °C durante 4 h.
3. Después de 4 h, bombee el medio completo a través del chip MOE a través de la entrada del medio a un caudal de 20 μL/h utilizando una bomba de jeringa.
   nota: Las mNPC se cultivan y se mantienen en el chip durante 24 horas adicionales antes de la estimulación de los campos eléctricos (FE) para permitir la unión y el crecimiento de las células. El líquido residual se recoge en una jeringa vacía de 5 mL conectada a la llave de paso de 3 vías de la salida, que se muestra como "residuo" en la Figura 6A. La configuración del sistema microfluídico MOE se muestra en la Figura 6. Este sistema microfluídico proporciona un suministro continuo de nutrición a las células. El medio fresco completo se bombea continuamente al chip MOE para mantener un valor de pH constante. Por lo tanto, las células se pueden cultivar fuera de una incubadora de CO₂.
4. Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexor EF al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl del chip. Conecte un multiplexor EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada con una magnitud de 300 mV/mm a una frecuencia de 100 Hz con ciclos de trabajo del 50 % (50 % de tiempo de encendido y 50 % de tiempo de apagado) (Figura 6B).
   1. Conecte los cables eléctricos al multiplexor EF. Conecte los cables eléctricos al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl.
   2. Conecte el multiplexor EF al amplificador mediante cables eléctricos. Conecte el generador de funciones al amplificador y al osciloscopio digital.
      nota: El multiplexor EF es un circuito que incluye la impedancia de la cámara de cultivo en el circuito y conecta todas las cámaras individuales en una red electrónica paralela. Cada una de las tres cámaras de cultivo está conectada eléctricamente en serie a una resistencia variable (Vr) y un amperímetro (mostrado como μA en la Figura 6A) en el multiplexor. La corriente eléctrica a través de cada cámara de cultivo se varía controlando el Vr, y la corriente se muestra en el amperímetro correspondiente. La intensidad del campo eléctrico en cada región de cultivo celular se calculó mediante la Ley de Ohm, I = σEA, donde I es la corriente eléctrica, σ (establecido como 1.38 S·^m-1 para DMEM / F12) es la conductividad eléctrica del medio de cultivo, E es el campo eléctrico y A es el área de la sección transversal de la cámara electrotáctica. Para la dimensión de la región de cultivo celular que se muestra en la Figura 1, la corriente eléctrica es de ~ 87 mA y ~ 44 mA para CC y pulso de CC al 50% del ciclo de trabajo, respectivamente.
5. Someta los mNPC a pulsos cuadrados de CC con una magnitud de 300 mV/mm a una frecuencia de 100 Hz durante 48 h. Bombee continuamente el medio completo a una velocidad de 10 μL/h para suministrar una nutrición adecuada a las células y mantener un valor de pH constante en el medio.

Resultados

Figura 1: Configuración detallada del chip electrotáctico ópticamente transparente multicanal.(A) Despiece del conjunto de chips MOE. El chip MOE consta de láminas de PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), cinta adhesiva de doble cara (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptadores (10 mm x 10 mm x 6 mm), lámina de PMMA de grado óptico (50 mm x 75 mm x 3 mm), cinta adhesiva de doble cara (24 mm x 60 mm...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sustratos de PMMA de 1 mm (Capas 1-3)	Bht	K2R20	Polimetacrilato de metilo (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Tubo de plástico de 15 ml	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Tubo cónico de fondo con tapón, ensamblado, preesterilizado
Jeringa de 3 mL	TERUMO	DVR-3413	Jeringas orales de 3 ml, sin aguja
PMMA de grado óptico de 3 mm (capa 5)	Corporación CHI MEI	Lámina de PMMA ACRYPOLY	PMMA de grado óptico
Llave de paso de 3 vías	NIPRO	NCN-3L	Llave de paso estéril desechable de 3 vías
Jeringa de 5 ml	TERUMO	DVR-3410	Jeringas orales de 5 ml, sin aguja
adaptador	Dong Zhong Co., Ltd.	Personalizado	Adaptador de PMMA
agarosa	Sigma-Aldrich	A9414	Agarosa, baja temperatura de gelificación
amplificador	A.A. Sistemas de Laboratorio Ltd	A-304	Amplificador de alto voltaje
Software AutoCAD	Autodesk	Versión Educativa	redacción
Suplemento B-27	Gibco	12587-010	Suplemento de B-27 (50x), menos vitamina A
Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	También se llama FGF-básico humano recombinante
Tapón de goma negra	TERUMO	DVR-3413	A partir de jeringas orales de 3 mL, sin aguja
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Reactivo de bloqueo
centrífuga	HSIANGTAI	CV2060	centrífuga
Trazador láser de CO2	Herramientas Láser y Technics Corp.	ILS-II	Comprado en http://www.lttcorp.com/index.htm
Conector de cono	IDEX Salud y Ciencia	F-120X	De una sola pieza, apretón con los dedos de 10-32 conos, para 1/16" de diámetro exterior natural
Adaptador Cone-Luer	IDEX Salud y Ciencia	P-659	Adaptador Luer 10-32 Hembra a Luer Hembra, PEEK
Microscopio de fluorescencia confocal	Microsistemas Leica	TCS SP5	Manual de usuario de Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
cámara digital	Olimpo	E-330	Adquisición automática de imágenes time-lapse
Osciloscopio digital	Tektronix	TDS2024	Mida señales de voltaje o corriente a lo largo del tiempo en un circuito o componente electrónico para mostrar la amplitud y la frecuencia.
Cinta adhesiva de doble cara	3M	PET 8018	Comprado en http://en.thd.com.tw/
Medio de águila modificado de Dulbecco/Mezcla de nutrientes de jamón F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, pólvora, HEPES
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco	Gibco	21600010	DPBS, polvo, sin calcio, sin magnesio
Multiplexor EF	Cielo Asiático Co., Ltd.	Personalizado	Supervisión y control de la corriente eléctrica en canales individuales
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	También se llama FEAG humano recombinante
Pegamento de cianoacrilato de acción rápida	3M	7004T	Resistencia del adhesivo instantáneo (líquido)
Conector de fondo plano	IDEX Salud y Ciencia	P-206	Tuerca macho sin brida Delrin, 1/4-28 de fondo plano, para 1/16" OD azul
Generador de funciones	Tecnologías Agilent	33120A	Generador de funciones sintetizadas de 15 MHz de alto rendimiento con capacidad de forma de onda arbitraria incorporada
Vidrio de óxido de indio-estaño (ITO)	Merck	300739	Para calentador ITO
Termopar tipo K	Tecpel	TPK-02A	Termopares de temperatura
Adaptador Luer	IDEX Salud y Ciencia	P618-01	Adaptador Luer hembra Luer a polipropileno macho 1/4-28
Jeringa Luer lock	TERUMO	DVR-3413	Para puentes de sal de agar
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Vida Básica	BL2651	Solución de lavado
Poli-L-Lisina (PLL)	sigma	P4707	Solución de recubrimiento
Espesor de cubreobjetos de precisión Nº 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Platina motorizada X-Y-Z programable	Tanlian Inc	Personalizado	Comprado en http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Controlador proporcional-integral-derivado (PID)	Toho Electrónica	TTM-J4-R-AB	Controlador de temperatura
Tubo de PTFE	Professional Plastics Inc. Sucursal de Taiwán	Diámetro exterior 1/16 pulgadas	Tubo de PTFE translúcido blanco
Bomba de jeringa	Sistemas de Nueva Era Inc	NE-1000	Bomba de jeringa única programable NE-1000
Detergente TFD4	FRANKLAB	TFD4	Limpiador de cubiertas de vidrio
Adhesivo térmico	Kuan-MIN Tech Co.	Personalizado	Comprado en http://kmtco.com.tw/
Limpiador ultrasónico	Leo	LEO-300S	Limpiador estéril ultrasónico
Cámara de vacío	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Horno de secado al vacío
Tapón blanco apretón de dedos	IDEX Salud y Ciencia	P-316	1/4-28 Fondo plano, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html