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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
La figura 1 ilustra una descripción general esquemática del flujo de trabajo de este protocolo.
1. Reprogramación y mantenimiento de iPSC
- Recoja 8 mL de la sangre del sujeto (paciente anciano o enfermo; de 65 años o más) en tubos de preparación celular (CPT) con citrato de sodio o en tubos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o heparinizados.
- Centrifugar a 1.800 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) para recoger los pellets que contienen sólo sangre periférica y no suero.
- Utilice vectores de reprogramación especializados de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales) para obtener iPSC.
- Cultivo de iPSCs en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (LDEV) y sin lactosa en medios Essential 8 (E8) (ver Tabla de Materiales) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
- Mantener las iPSCs en medios E8 durante 3-4 días para evitar el hacinamiento o la diferenciación espontánea.
- Validar la pluripotencia de las líneas de iPSC utilizando marcadores inmunofluorescentes (paso 2) y realizar pruebas de micoplasma (paso 3).
>2. Tinción de pluripotencia
- Para conservar las soluciones y los anticuerpos, siembre las células en placas de cultivo de 24 pocillos recubiertas (paso 1.4) 3-4 días antes del análisis. Aspire el medio con una pipeta y fije las células con formaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) durante 15-20 minutos a RT.
- Lave las células 3 veces con PBS 1x y permeable con Triton-X 100 al 0,1% en albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante al menos 15 min, pero no más de 1 h a RT.
- Lavar 3 veces con 1x PBS y bloquear con 5% de BSA en PBS durante 30 min en RT.
- Lavar de nuevo 3 veces con PBS 1x y añadir los anticuerpos Sox2 y Oct3/4 (dilución 1:100; ver Tabla de Materiales), y la tinción nucleica DAPI en BSA al 1% (dilución 1:4.000) durante la noche a 4 °C. Envuelva en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Lave 3 veces con 1x PBS y deje las celdas en PBS. Imagen con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 10-20x. Asegúrese de que los marcadores de pluripotencia Y-box 2 (Sox2) y el factor de transcripción de unión al octámero 3/4 (Oct3/4) estén localizados en los núcleos de las células.
>3. Pruebas de micoplasma
>NOTA: Consulte el protocolo del kit de detección (consulte la Tabla de materiales) para conocer los pasos detallados de la ejecución del ensayo y el análisis. El kit de detección proporciona el reactivo, el sustrato y el tampón de ensayo para las pruebas de micoplasma.
- Antes de pasar las células o el medio refrescante, recoja 2-3 mL de medio de cultivo celular en un tubo de centrífuga y granule las células o residuos a 200 x g durante 5 min en RT. Almacene el sobrenadante a 4 °C durante ≤5 días. Incubar las células con el medio durante al menos 24 horas para garantizar una señal detectable.
- Agregue 100 μL de sobrenadante celular a un tubo nuevo o pocillo de una placa de 96 pocillos de paredes blancas (se recomienda un fondo opaco, consulte la tabla de materiales). Reconstituya el reactivo y el sustrato en el tampón de ensayo y equilibre durante 15 min en RT.
- Agregue 100 μL del reactivo a la muestra e incube durante 5 min en RT. Mida la luminiscencia con un luminómetro (medición # 1).
- Agregue 100 μL del sustrato a la muestra e incube durante 10 min en RT. Mida la luminiscencia (medición # 2).
- Determine la contaminación por micoplasma mediante la relación de medición #2 a #1. Consulte el manual del kit para interpretar los resultados.
4. Preparación de microfilamentos
- Comience la preparación de los microfilamentos de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, ver Tabla de Materiales) deshilachando la hebra de sutura con el extremo romo de un bisturí. Esteriliza ligeramente la fibra deshilachada con etanol al 70%.
- Bajo el microscopio y usando una regla, comience a cortar la fibra PLGA en fragmentos de hebras de 500 μm a 1 mm de largo. Corta unos 25 mm de la fibra en total. Mantenga los filamentos en un tubo de 15 mL con una solución antibiótica-antimicótica de 1 mL.
- En la campana, diluya la solución de fibra con 10 mL de DMEM/F-12 (Tabla 1). Pozo de vórtice para mezclar la solución.
nota: Trabaje en una campana de flujo de cultivo celular en un entorno estéril.
- Agregue 20 μL de la solución de fibra a tres pocillos de formación de cuerpos embrioides (EB) de una placa de 96 pocillos. Bajo microscopía de campo claro, cuente y promedie las fibras por pocillo. Diluir o concentrar hasta un promedio de 5-10 microfilamentos PLGA por pocillo. Prepara cada pozo de esta manera.
- Los pozos ya están listos para ser sembrados con células. Guarde el plato a temperatura ambiente hasta que lo necesite o a 4 °C para el día siguiente.
>5. Formación del cuerpo embrioide (EB)
NOTA: Todos los medios y soluciones deben calentarse a RT.
- Una vez que las iPSCs han alcanzado el 70%-80% de confluencia (Figura 2A), están listas para ser pasadas y utilizadas para la formación de EB. Revise las células con un microscopio con un aumento de 10x-20x. Asegúrese de que las colonias muestren áreas mínimas (<10%) de diferenciación espontánea.
- Aspire el medio con una pipeta y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Disociar las colonias añadiendo 500 μL de solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales) o 0,5 mM de EDTA e incubar durante 3-5 min a 37 °C.
nota: Trabaje en una campana de flujo de cultivo celular en un entorno estéril.
- Recoja las células liberadas añadiendo 1 ml de medio E8 fresco a cada pocillo y pipetee suavemente hasta que se desprendan todas las células.
- Transfiera 1,5 mL de suspensión celular a un tubo de 15 mL y agregue otro 1 mL de medio E8 fresco para alcanzar un volumen total de 2,5 mL.
- Centrífuga a 290 x g durante 3 min en RT.
- Aspire el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de medio Essential 6 (E6, consulte la tabla de materiales) suplementado con 50 μM de inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho (ROCK) y cuente las células con un hemocitómetro.
- Prepare una suspensión celular de 60.000-90.000 células/mL, dependiendo de la densidad de siembra deseada, en medios E6 suplementados con 50 μM de inhibidor de ROCK (ver Tabla de Materiales).
- Agregue 150 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja (ULA) de 96 pocillos (o una placa cóncava preparada). Siembra de 9.000 a 11.000 células por pocillo.
- Centrifugar la placa para forzar la adición de las células a 290 x g durante 1 min en RT. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
>6. Inducción neuroepitelial
- Después de 24 h, aspire cuidadosamente 120 μL del medio con una pipeta. Asegúrese de no aspirar el EB bajando demasiado la punta de la pipeta en el pocillo.
- Añadir 150 μL de medio E6 (en RT) suplementado con 2 μM de XAV939 y el Supresor de Madres frente a inhibidores decapentopléjicos (SMAD): 10 μM de SB431542 y 500 nM de LDN 193189 por pocillo (ver Tabla de Materiales).
- Cambie el medio diariamente con medios E6 recién preparados complementados con 2 μM de XAV939, 10 μM de SB431542 y 500 nM de LDN 193189.
nota: Para el día 6 (DIV6), los EB deben tener un diámetro de 550-600 μm y estar listos para una mayor diferenciación.
>7. Diferenciación y maduración de organoides
NOTA: Todos los medios necesitan ser calentados a RT.
- Aproximadamente en DIV7, verifique si todos los EB han alcanzado un diámetro de 550-600 μm y muestran un borde liso y claro (Figura 2B); en esta etapa, están listos para ser incrustados en una matriz extracelular (ECM).
nota: Trabajar en un ambiente estéril.
- Prepare láminas de inclusión con hoyuelos a partir de la película de sellado termoplástica (consulte la Tabla de materiales) colocando una hoja de película (de aproximadamente 4 pulgadas de largo) en una caja P200 vacía. Con un tubo cónico de 15 ml o un tubo de microcentrífuga de 500 μl, presione suavemente la lámina de película en los orificios para hacer 12 hoyuelos. Rocíe la lámina de película con etanol al 70% y déjela secar dentro de la campana de flujo con la luz ultravioleta encendida durante al menos 30 minutos.
- Descongele una cantidad suficiente de matriz de membrana basal (Matrigel, ver Tabla de Materiales) sobre hielo y colóquela dentro de la campana de flujo.
nota: Por EB, se necesitan aproximadamente 30 μL de matriz de membrana sin diluir. Mantenga siempre la matriz de la membrana por debajo de 4 °C para evitar que se gelifique. También se recomiendan las puntas de pipeta preenfriadas, ya que desaceleran la polimerización de la matriz en la punta durante el pipeteo, lo que reduce la pérdida de material.
- Con una punta P200 de diámetro ancho, transfiera un EB a cada hoyuelo y elimine la mayor cantidad de medio posible con una punta de pipeta normal. Tenga cuidado de no dejar que los EB se sequen. Con una punta P200 normal, agregue ~ 30 μL de matriz de membrana sin diluir a cada organoide, asegurándose de que el EB esté en el centro de la gota.
- Una vez que todos los EB estén incrustados en la matriz, coloque la hoja de película que contiene los EB en una placa de Petri estéril.
nota: Opcionalmente, se puede colocar una pequeña placa de Petri llena de agua estéril en la placa de Petri más grande junto a la lámina de película para evitar la evaporación.
- Transfiera la placa a una incubadora e incube a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante aproximadamente 10 minutos para permitir que la matriz de membrana se solidifique.
- Para cada conjunto de 12 organoides incorporados, prepare 5 mL de medio de diferenciación con B27 sin vitamina A (Tabla 1) en un pocillo de una placa de ULA de 6 pocillos. Precalentar la placa a 37 °C en una incubadora.
- Una vez finalizado el tiempo de incubación, transfiera los EB incrustados a la placa ULA de 6 pocillos tomando la lámina de película y empujando los hoyuelos desde la parte posterior de la hoja. Si es necesario, tome 1 ml del pocillo y plételo en la lámina para ayudar a que las gotas se desprendan de la película><.
nota: Se pueden observar cambios morfológicos importantes 1 día después de la incrustación; Las EB pasan de tener bordes lisos a protuberancias abultadas formando yemas (Figura 2C).
- Después de 2 días (DIV9), realice un cambio de medio medio. Tenga cuidado de no aspirar o dañar las gotas de la matriz de la membrana en el proceso.
- Después de 2 días más (DIV11), realice un cambio completo de medio, complementando el medio con 3 μM de CHIR99021 (consulte la tabla de materiales).
- En DIV14, cambie el medio a un medio de diferenciación con B27 con vitamina A (Tabla 1) para un aumento gradual en el tamaño del organoide.
- En DIV16, coloque la placa de pocillo en un agitador orbital a 90 rpm dentro de una incubadora. Cambie el medio cada 2 días.
- Cada 40 DIV, diluya 500 μL de la matriz de membrana por cada 50 mL de medio para obtener nutrientes adicionales en el medio.
Tabla 1: Composición de los medios de diferenciación utilizados en el presente estudio.
| Reactivo | Concentración final | Volumen (50 mL en total) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 mL |
| Medio Neurobasal | 50% | 25 mL |
| Suplemento N2 (100x) | 1 vez | 0,25 ml |
| Suplemento de B27 -/+ Vitamina A (50x) | 0.5x | 0,5 ml |
| insulina | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1 vez | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0.5x | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiótico/Antimicótico (100x) | 1 vez | 0,5 ml |
| 2-β-mercaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| NOTA: algunos DMEM-F12 ya contienen GlutaMAX, no es necesario añadir adicional. |
