Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
Todos los reactivos y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales y deben usarse estériles. Los medios deben calentarse a temperatura ambiente (RT) antes de su uso, a menos que se especifique lo contrario. Para obtener una descripción general del protocolo de cocultivo, consulte la Figura 1.
1. Diferenciación de progenitores de neuronas motoras a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)
- Seguir el protocolo de diferenciación de neuronas motoras, adaptado de un estudio previo, hasta alcanzar el estado de progenitores neuronales (NPCs) del día 10. De acuerdo con el marco de tiempo del protocolo, la diferenciación se inicia un lunes (día 0), lo que da como resultado NPC del día 10 un jueves.
- Criopreservar NPCs de día 10 en reemplazo de suero knock-out con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a una densidad de 2 x 106- 4 x 106 células por vial.
cautela: El DMSO es tóxico: mango en una campana extractora con equipo de protección personal.
NOTA: Se espera que aproximadamente el 50% de los 10 NPC del día sean vitales al descongelarse. Detenga el protocolo de diferenciación de neuronas motoras en este estado de 'NPC del día 10' y criopreserva los NPC para generar una gran cantidad de NPC, que se pueden almacenar y usar más tarde, reduciendo la longitud de la línea de tiempo general del protocolo de cocultivo de 28 días a 19 días en total.
>2. Derivación y mantenimiento de mesoangioblastos humanos (MABs)
>NOTA: Las MAB son células madre mesenquimales asociadas a vasos, que en este caso se han extraído de biopsias obtenidas de un donante sano de 58 años. Existen fuentes comerciales alternativas. Se explica brevemente el protocolo para la obtención de MABs. Para obtener más información, consulte el protocolo detallado. Todos los medios MAB deben calentarse a 37 °C antes de su uso.
- Picar el tejido de la biopsia e incubar en platos de 6 cm recubiertos de colágeno (de piel de becerro) en un medio de crecimiento (Tabla 1) durante 2 semanas. Cambie el medio cada 4 días.
- Para preparar el recubrimiento de colágeno, disuelva 100 mg de colágeno en 20 ml de ácido acético 0,1 M. El colágeno tarda en disolverse, así que coloca la mezcla en una plataforma oscilante durante la noche en RT. Al día siguiente, rellene con 80 mL de ddH2O hasta un volumen final de 100 mL.
cautela: El ácido acético es tóxico; Mango en una campana extractora con equipo de protección personal.
nota: El colágeno del recubrimiento de piel de becerro se puede reutilizar hasta 5 veces. Conservar a 4 °C.
- Cubrir toda la superficie del plato o del matraz con colágeno, cerrar e incubar durante 20 min a RT dentro de un flujo laminar. Después de 20 min, recuperar el colágeno en un recipiente nuevo, cerrar el plato/matraz vacío y dejar durante 10 min a RT en el flujo laminar.
- Transfiera la placa/matraz a la incubadora para una incubación nocturna (o al menos 6 h) (37 °C, 5% CO2). Lavar 5 veces con la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (DPBS) antes de colocar las celdas.
- Después de 14 días, FACS (clasificación de células activadas fluorescentes) clasifica los MAB para la fosfatasa alcalina humana seguida de una mayor expansión. Mantenga los MAB en matraces T75 recubiertos de colágeno en el medio de crecimiento y cambie el medio de crecimiento cada 2 días (10 ml por matraz).
- Criopreservar, pasar o sembrar MAB en dispositivos cuando se alcance el 70% de confluencia.
nota: Los MAB pierden su potencial miogénico debido a fusiones espontáneas al entrar en contacto entre células. Asegúrese de no exceder el 70% de confluencia cuando expanda los MAB. Un matraz T75 confluente al 70% contiene aproximadamente 600.000-800.000 células, que pueden criopreservarse a 100.000 células por vial. Posteriormente, cada vial se puede descongelar y sembrar en un matraz T75 para su expansión.
- Para pasar los MAB, lávelos suavemente una vez con 7 mL de DPBS y luego incube en 7 mL de solución de disociación de MAB durante 3 min a 37 °C en 5% de CO2 para disociar las células.
- Neutralice la solución de disociación del MAB con 7 mL del medio de crecimiento, raspe suavemente las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 mL. Lave suavemente el matraz con 5 ml adicionales del medio de crecimiento para recoger los MAB potencialmente restantes.
- Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 300 x g, luego pasarla directamente a un nuevo matraz T75 recubierto de colágeno para su expansión, criopreservar en un reemplazo de suero knock-out con DMSO al 10% o contar hasta sembrar en un dispositivo microfluídico.
NOTA: Los pases se realizan 1x-2x por semana para la expansión celular hasta un número máximo de pases de 13. Tras la disociación, los MAB parecen esféricos y de forma grande cuando se examinan bajo el microscopio.
3. Preparación de dispositivos microfluídicos premontados - Día 9
NOTA: El protocolo está adaptado del protocolo de dispositivos neuronales del fabricante del dispositivo microfluídico y se ha ajustado para el uso de dispositivos premontados y de silicona. Aquí, los dispositivos preensamblados se utilizan para la inmunocitoquímica (ICC) y los registros transitorios de calcio de células vivas, mientras que los dispositivos de silicona se utilizan para la microscopía electrónica de barrido (SEM). La línea de tiempo del protocolo sigue la línea de tiempo para el protocolo de diferenciación de neuronas motoras.
- Prepare los dispositivos microfluídicos el día antes de sembrar las células, ya que el recubrimiento debe incubarse durante la noche. De acuerdo con el protocolo de la neurona motora, esto será un miércoles. Agregue ~ 10 mL de etanol al 70%-100% a una placa de Petri de 10 cm. Use fórceps para transferir el dispositivo desde el contenedor de envío hasta la placa de Petri para la esterilización.
- Sumerja el dispositivo en etanol durante 10 s y transfiera el dispositivo con pinzas a una hoja de papel para que se seque al aire en el flujo laminar durante ~30 min. Voltee el dispositivo varias veces para permitir que ambos lados se sequen. Cuando el dispositivo esté seco, use pinzas para mover cada dispositivo a una placa de Petri individual de 10 cm para facilitar su manejo.
cautela: El etanol es tóxico; Mango en una campana extractora con equipo de protección personal
- Cubrir el dispositivo con poli-L-ornitina (PLO) (100 μg/mL) en DPBS e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 h.
- Utilice una pipeta P200 para añadir 100 μL de PLO en DPBS en un pocillo superior lo más cerca posible de la abertura del canal y observe el paso del fluido desde el pocillo superior a través del canal hasta el pocillo inferior. Posteriormente, agregue 100 μL de PLO en DPBS al pocillo inferior.
- Repita en el otro lado de las microranuras y termine agregando 100 μL en un lado del dispositivo para crear un gradiente de volumen entre los dos lados espejados del dispositivo para recubrir las microranuras (por ejemplo, lado derecho 200 μL, lado izquierdo 300 μL). Después de 3 h, lave el dispositivo 3 veces durante 5 minutos con DPBS. Utilice un sistema de succión si es necesario.
nota: Asegúrese de evitar la formación de burbujas de aire en los canales en cualquier momento durante el recubrimiento o cultivo de las células. Incluso las burbujas pequeñas se expandirán en un corto período de tiempo, inhibiendo así el recubrimiento, la siembra de células o el flujo de medios a través del canal. Si el fluido se detiene en el canal durante el recubrimiento, vuelva a suspender la solución de PLO directamente en el canal desde ambos lados. Si todavía hay burbujas, use 200 μL de DPBS para enjuagar el canal y repita el proceso de recubrimiento como se indicó anteriormente en los pasos 3.3.1-3.3.2. Si aparecen burbujas después de la siembra de células, es imposible recuperar el dispositivo, ya que lavar el canal dañará las células.
- Cubrir el dispositivo con laminina (20 μg/mL) en un medio Neurobasal e incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. Siga las mismas instrucciones para el recubrimiento PLO de los pasos 3.3.1-3.3.2.
- Al día siguiente, utilice una pipeta P200 y coloque la punta en el pocillo opuesto a la abertura del canal para eliminar el recubrimiento de laminina de los pocillos. Agregue DPBS a todos los pocillos y deje los dispositivos con DPBS en el flujo laminar en RT para la siembra de células.
NOTA: A partir de este punto, es importante no eliminar líquido (recubrimiento de laminina, DPBS, medios, solución de fijación, etc.) directamente de los canales, ya que esto podría causar la formación de burbujas de aire. Inspeccione siempre los dispositivos bajo el microscopio antes de sembrar las células.
>4. Recubrimiento de NPCs en dispositivos microfluídicos - Día 10
NOTA: De acuerdo con el protocolo de diferenciación de las neuronas motoras, el enchapado de los NPC del día 10 ocurre un jueves.
- Utilice NPCs del día 10 recién disociadas, o descongele 1-2 viales de NPCs almacenadas por cada 10 mL de medio de neurona motora del día 10 (Tabla 2 y Tabla 3) con una solución de inhibidor de ROCK (10 μL/mL) y centrifugar la suspensión celular a 100 x g durante 4 min.
- Vuelva a suspender el pellet de células en 500-1000 μL de medio de neurona motora del día 10 con solución de inhibidor de ROCK (10 μL/mL) y cuente las células vivas utilizando cualquier método de recuento preferido.
nota: Como se indica a continuación, asegúrese de volver a suspender los NPC en la cantidad correcta de medios para acomodar un volumen de siembra óptimo.
- Retire los DPBS de dos pocillos en un lado de las microranuras del dispositivo con una pipeta P200 y siembre 250.000 NPC por dispositivo en 60-100 μL de medios de neuronas motoras del día 10.
- En el pocillo superior derecho, siembre 30-50 μL de la suspensión celular (125.000 celdas) cerca de la abertura del canal en un ángulo de 45° y arrastre el fluido restante suavemente a lo largo del suelo del pozo hacia el centro del pozo con la punta de la pipeta.
- Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de repetir esto en el pozo inferior (125,000 celdas en 30-50 μL). Utilice un bolígrafo para marcar el lado sembrado "NPC" o equivalente para facilitar la orientación del dispositivo sin necesidad de un microscopio.
- Incubar el dispositivo a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min para permitir la adhesión de las células antes de rellenar los pocillos de dos semillas con un medio de neurona motora adicional del día 10 (total 200 μL/pocillo) e incubar de nuevo a 37 °C, 5% de CO2,
nota: Cada pocillo puede contener 200 μL. La siembra de células tanto en pocillos como en canales garantiza una estructura robusta del cultivo, lo que reduce el riesgo de desprendimiento de células durante los cambios de medio. Es posible sembrar menos células solo en el canal. Sin embargo, esto hará que el cultivo sea más susceptible a la corriente de volumen a través de los canales durante cada cambio de medio.
- Utilice una pipeta P200 para eliminar los DPBS de los dos pocillos situados al otro lado de las microranuras opuestas a los NPC recién sembrados. Añada 200 μL/pocillo de medio de neurona motora del día 10 y espere unos segundos entre el pocillo superior e inferior para permitir que el medio fluya a través del canal. Luego, agregue 6 mL de DPBS por plato de 10 cm alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio durante la incubación.
nota: Agregue DPBS adicionales alrededor del dispositivo durante el período de cultivo si es necesario.
- Realice un cambio completo del medio de la neurona motora en ambos compartimentos del dispositivo el día 11 (viernes), el día 14 (lunes) y el día 16 (miércoles) (Tabla 2 y Tabla 3). Agregue suplementos de medios frescos el día del cambio de medio.
nota: A partir de este momento, realice todos los cambios de medio con una pipeta P200. Coloque siempre la punta de la pipeta lejos del canal en el borde del pocillo y no extraiga el líquido directamente del canal. Tenga cuidado de no separar los dispositivos de silicona. La extracción y adición del medio debe hacerse lentamente para evitar el desprendimiento de células.
- Retire con cuidado todos los medios de ambos pocillos con NPC colocando la punta de la pipeta P200 en el borde inferior de la pared del pocillo opuesto a la abertura del canal. Añada lentamente 50-100 μL de medio de neurona motora fresco al pocillo superior colocando la punta de la pipeta P200 en el borde superior de la pared del pocillo opuesta a la abertura del canal.
- Haga una pausa durante unos segundos para permitir que el medio fluya a través del canal antes de agregar 50-100 μL de medio de neurona motora al pozo inferior. Repita este proceso cuidadosamente hasta que ambos pocillos contengan 200 μL/pocillo. Repita en el lado sin celdas.
>5. Recubrimiento de MAB en dispositivos microfluídicos - Día 17
- Aproximadamente 7 días antes de sembrar los MAB en los dispositivos microfluídicos (día 10 de diferenciación de las neuronas motoras), descongele los MAB y siembrócelos en el medio de crecimiento (Tabla 1) en un matraz T75 recubierto con colágeno para permitir una expansión celular suficiente. Véase la sección 2.
- En el día 17 de la diferenciación de las neuronas motoras (jueves), disocie los MAB como se explica en el paso 2.4, vuelva a suspender el pellet de células en ~ 500 μL de medio de crecimiento y cuente las células vivas utilizando cualquier método de conteo preferido.
nota: Como se indica a continuación, asegúrese de volver a suspender los MAB en la cantidad correcta de medios para acomodar el volumen óptimo de siembra.
- Retire el medio de la neurona motora en el lado sin semillas de las microranuras del dispositivo con una pipeta P200, lávese suavemente con DPBS y siembre 200.000 MAB por dispositivo en 60-100 μL de medio de crecimiento.
- En el pocillo superior derecho, siembre 30-50 μL de suspensión celular (100.000 celdas) cerca de la abertura del canal en un ángulo de 45° y arrastre el fluido restante suavemente a lo largo del suelo del pozo hacia el centro del pocillo con la punta de la pipeta. Haga una pausa de unos segundos para permitir el flujo de células a través del canal antes de repetir en el pozo inferior (100.000 células en 30-50 μL).
- Incubar el dispositivo a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min para permitir la adhesión de las células antes de rellenar los dos pocillos recién sembrados con MAB con medio de crecimiento adicional (total 200 μL/pocillo). Incubar de nuevo a 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: No es necesario cambiar el medio el día 17 en el lado de la neurona motora del dispositivo. El cambio de medio del día 17 según el método de diferenciación de neuronas motoras publicado anteriormente se realiza el día 18 (viernes).
>6. Implementación de un gradiente volumétrico y quimiotáctico para promover el crecimiento de neuritas de neuronas motoras hacia el compartimento MAB
- El día 18, realice un cambio completo del medio en el lado de la neurona motora con el medio de la neurona motora del día 18 (200 μL/pocillo). Siga las instrucciones para los cambios de medio mencionados en los pasos 4.5.1-4.5.2. Inicie la diferenciación MAB en el compartimento MAB del dispositivo (Tabla 2 y Tabla 4).
- Lave cuidadosamente los compartimentos MAB una vez con DPBS antes de agregar medio de diferenciación MAB precalentado (Tabla 4) suplementado con 0,01 μg/mL de agrina humana (200 μL/pocillo).
nota: Los MAB se fusionarán y formarán miotubos multinucleados en el transcurso de una semana.
- El día 21, según el protocolo de diferenciación de neuronas motoras (lunes), iniciar el gradiente quimiotáctico y volumétrico (Tabla 2 y Tabla 3).
- Añada 200 μL/pocillo de medio basal de la neurona motora con 30 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y factor neurotrófico ciliar (CNTF), agrina humana (0,01 μg/mL) y laminina (20 μg/mL) al compartimento del miotubo (previamente definido como compartimento MAB). Añadir medio basal de la neurona motora (100 μL/pocillo) sin factores de crecimiento al compartimento de la neurona motora.
Tabla 1: Medio de crecimiento MAB.El medio puede durar 2 semanas a 4 °C. El bFGF se añade fresco el día de su uso.
| Reactivo | Concentración de existencias | Concentración final |
| IMDM | 1 vez | 80% |
| Suero fetal bovino | | 15% |
| Penicilina/Estreptomicina | 5000 U/mL | 0.5% |
| L-glutamina | 50 veces | 1% |
| Piruvato de sodio | 100 mM | 1% |
| Aminoácidos no esenciales | 100 veces | 1% |
| Insulina transferrina selenio | 100 veces | 1% |
| bFGF (añadido fresco) | 50 μg/mL | 5 ng/mL |
Tabla 2: Medio basal de la neurona motora.El medio puede durar 4 semanas a 4 °C.
| Reactivo | Concentración de existencias | Concentración final |
| DMEM/F12 | | 50% |
| Medio neurobasal | | 50% |
| Penicilina/Estreptomicina | 5000 U/mL | 1% |
| L-glutamina | 50 veces | 0.5 % |
| Suplemento N-2 | 100 veces | 1% |
| B-27 sin vitamina A | 50 veces | 2% |
| β-mercaptoetanol | 50 mM | 0.1% |
| ácido ascórbico | 200 μM | 0,5 μM |
Tabla 3: Suplementos de medio para neuronas motoras.Los suplementos se añaden frescos el día de su uso al medio basal de la neurona motora.
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| día | Reactivo | Concentración de existencias | Concentración final | compartimiento |
| Día 10/11 | Agonista suavizado | 10 mM | 500 nM | ambos |
| Ácido retinoico | 1 mM | 0,1 μM | |
| DAPT | 100 mM | 10 μM |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| GDNF (en | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Día 14 | DAPT | 100 mM | 20 μM | ambos |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF (en | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Día 16 | DAPT | 100 mM | 20 μM | ambos |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF (en | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Día 18 | BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | Neurona motora |
| GDNF (en | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Día 21+ | BDNF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | Miotubo |
| GDNF (en | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL |
| Agrina | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
| Laminina | 1 mg/mL | 20 μg/mL |
| Día 21+ | Sin suplementos | | | Neurona motora |
Tabla 4: Medio de diferenciación MAB.El medio puede durar 2 semanas a 4 °C. El agrin se añade fresco el día de su uso.
| día | Reactivo | Concentración de existencias | Concentración final | compartimiento |
| Día 18 | DMEM/F12 | | 97% | MAB |
| Piruvato de sodio | 100 mM | 1% |
| Suero de caballo | | 2% |
| Agrina | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
