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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Disección de embriones y disociación de tejido
- Aloje ratas hembras adultas (200-250 g) a una temperatura constante (22 ± 1 °C) y humedad relativa (50%) bajo un horario regular de luz-oscuridad (encendido de 7 a.m. a 7 p.m.) en el animalario. Asegurar que los alimentos y el agua estén disponibles libremente.
- Anestesiar una rata hembra preñada después de 18 días de desarrollo (E18) usando isoflurano al 3%. Luego, sacrificar al animal por luxación cervical.
- Retire los hipocampos de cada embrión de rata y colóquelos en una solución salina equilibrada de Hank helada sin Ca2+ y Mg2+. En el día 18 de desarrollo, los tejidos del hipocampo y la corteza son muy blandos y no necesitan ser cortados en pedazos pequeños. Se pueden encontrar más detalles.
- Disociar el tejido en una solución de tripsina al 0,125% que contiene un 0,05% de ADNasa durante 18-20 min a 37 °C.
- Retirar la solución sobrenadante con una pipeta Pasteur y detener la digestión enzimática añadiendo medio con un 10% de suero fetal bovino (FBS) durante 5 min.
- Retirar el medio con FBS y lavar una vez con el medio con su suplemento, L-glutamina al 1%, gentamicina 10 μg/ml. Retirar de nuevo el medio con una pipeta Pasteur y volver a llenarlo con una pequeña cantidad (500 μl) de medio de crecimiento con su suplemento, L-glutamina al 1%, gentamicina 10 μg/ml.
- Disocie el gránulo de tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur estrecha hasta que se manifieste una suspensión lechosa de células. No es necesario centrifugar la suspensión celular.
- Diluir el pequeño volumen de suspensión celular con el medio de crecimiento para obtener un volumen final de 2,0 ml. Contar la concentración celular obtenida con una cámara de hemocitómetro. Diluir esta concentración a 1:5 para obtener la concentración celular deseada de 600-700 células/μl.
>2. Recubrimiento de celdas
- Células de placa a una densidad de aproximadamente 2.000 células/mm2 en el área activa del MEA, definida por la restricción PDMS para crear una red neuronal 2D.
nota: Cada hipocampo contiene aproximadamente 5 x 105 células (1 x 106 para un solo embrión). Diseccionar 6 embriones para obtener una cantidad total de 6 x 106 células en 2 ml, y una concentración estimada de 3.000 células/μl. Diluir esta concentración a 1:5 para obtener la concentración celular deseada y colocar una placa de unas 600-700 células/μl. Si el área MEA delimitada por la restricción PDMS es de aproximadamente 7,065mm2, y el número total de células plateadas 600 células/μl x 24 μl = 14.400 células, la densidad final es de 2.038 células/mm2.
- Coloque los dispositivos MEA en la incubadora con una atmósfera humidificada deCO2 (5%) a 37 °C.
- Distribuya 160 μl de la suspensión con una concentración celular de 600-700 células/μl (alrededor de 100.000 células) sobre la superficie de la monocapa de microperlas colocada dentro de las placas de pocillos múltiples para completar el paso preliminar para construir el cultivo tridimensional. Coloque las placas multipocillos en la incubadora con atmósfera humidificada deCO2 (5%) a 37 °C.
3. 3D Construcción de redes neuronales
- 6-8 horas después del recubrimiento, transfiera la suspensión (microesferas con neuronas) de las placas de pocillos múltiples con mucho cuidado dentro del área delimitada por la restricción PDMS utilizando un juego de pipetas para un volumen de aproximadamente 30-40 μl. Después de cada transferencia, espere aproximadamente medio minuto, para permitir que las microperlas se autoensamblen en una estructura compacta hexagonal.
- Una vez que todas las capas estén depositadas y ensambladas espontáneamente, vuelva a llenar con una gota grande de aproximadamente 300 μl de medio la parte superior del área delimitada por la restricción PDMS.
- Coloque la estructura 3D acoplada al MEA en la incubadora (T = 37,0 °C, CO2 = 5%) durante 48 horas antes de agregar un volumen final (aproximadamente 1 ml) de cultivo en medio de crecimiento con su suplemento><.
nota: Considere el número total de cordones en las placas de pocillos múltiples con inserto de membrana (30.000) y el número de cordones en una sola capa en el dispositivo MEA (6.000). La estructura 3D resultante se compone de 5 capas de microperlas y células. Teniendo en cuenta que la red neuronal 3D no es geométricamente perfecta, la estructura 3D resultante podría comprender de 5 a 8 capas.
- Al día siguiente del enchapado, agregue con cuidado el volumen final del medio (aproximadamente 900 μl) dentro del anillo MEA. Mantener los cultivos 3D en una atmósfera humidificada deCO2 (5%) a 37 °C durante 4-5 semanas. Reemplace la mitad del medio una vez a la semana.