Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación y cultivo de astrocitos corticales
NOTA: Complete estos pasos del protocolo al menos 7 días antes de continuar con los siguientes pasos, ya que los cultivos de astrocitos deben convertirse en monocapas confluentes antes de que se preparen las neuronas. Los astrocitos primarios se derivan de cultivos gliales mixtos obtenidos de crías de ratón alrededor del día postnatal (P) 0-3. Se deben utilizar tres cerebros (6 cortezas) por matraz T75.
- Prepare el medio de astrocitos complementando el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% v/v de suero de caballo y 0,1% v/v de gentamicina en condiciones estériles. Almacene el medio a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Cubra 3 matraces T75 con 10 μg/mL de poli-D-lisina (PDL; en agua apta para cultivo celular) durante al menos 1 h a 37 °C en presencia de 6% v/v de CO2. Después del recubrimiento, lave los matraces dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los cationes no unidos y agregue 9 mL de medio de astrocitos.
- Para la preparación de los cerebros, agregue 10 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 1 placa de Petri de 10 cm y 1 ml de HBSS a 1 tubo de 15 ml (independientemente del número de cerebros que se utilizarán). Tenga a mano un par de tijeras quirúrgicas, 2 pinzas finas y un binocular para el procedimiento.
- Decapita rápidamente a 3 cachorros con las tijeras quirúrgicas y recoge las cabezas en un plato vacío de 10 cm.
- Realice la preparación de las cortezas bajo los prismáticos. Con dos pinzas finas, retire la piel dorsal del cráneo en la línea media, comenzando desde el cuello hasta el nivel de los ojos. A partir de entonces, el cerebro con sus vasos sanguíneos es visible debajo del cráneo.
- Fije la cabeza en el extremo rostral con un par de pinzas y haga una incisión en la línea media del cráneo, comenzando en el extremo posterior. Posteriormente, corte las mitades derecha e izquierda del cráneo para exponer el cerebro.
- Cierre la punta de las pinzas y colóquela ventralmente debajo del cerebro. Levante el cerebro del cráneo y transfiéralo a la placa de Petri de 10 cm llena de HBSS. Proceda de la misma manera con el espécimen restante hasta que todos los cerebros estén recogidos en el plato.
- Después de recolectar los cerebros, comience con la separación de las cortezas pellizcando el cerebro posterior con un par de pinzas como si fueran unas tijeras. Realice una incisión en la línea media entre los dos hemisferios con un par de pinzas. Fije cuidadosamente el cerebro con una pinza y corte el mesencéfalo y los bulbos olfativos con una segunda pinza para terminar con las mitades corticales.
- Fije una mitad cortical con un par de pinzas y retire las meninges de los hemisferios separándolas del borde lateral y posteriormente tirando de ellas de la superficie cortical con una segunda pinza.
- Voltee la mitad cortical con su superficie orientada hacia el plato; diseccione cuidadosamente y retire el hipocampo en forma de media luna con un par de pinzas. Transfiera las cortezas individuales al tubo cónico de 15 ml usando una pinza cerrada para transportar una corteza individual.
- Después de recolectar todas las cortezas, transitar a la campana de flujo laminar estéril y comenzar con los preparativos para la disociación del tejido cortical.
- Agregue 1 mL de DMEM a un tubo de reacción de 2 mL y agregue 0.1% p/v de papaína (30 unidades). Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 °C hasta que se desarrolle una solución clarificada (unos 3 min). Añadir 0,24 mg/mL de L-cisteína y 20 μg/mL de ADNasa y agitar suavemente.
NOTA: Para la digestión, se necesita aproximadamente 1 mL de solución enzimática.
- Filtrar (tamaño de poro de 0,22 μm) para obtener 1 mL de solución estéril antes de añadirla al tejido cortical. Incubar los tubos durante 30 min - 1 h a 37 °C (es decir, en un baño de agua).
NOTA: Los pasos 1.11 a 1.14 son críticos y deben completarse en 15 minutos.
- Para finalizar la reacción de digestión, agregue 1 mL de medio astrocitario y triture cuidadosamente el tejido digerido con una pipeta de 1 mL. Para la trituración, mueva suavemente el émbolo de la pipeta, aspirando y extruyendo así la suspensión de tejido cortical.
- Una vez que el tejido se haya disociado en una suspensión unicelular, agregue 5 mL de medio astrocito y centrifugue durante 5 min a 216 x g.
- Aspire el sobrenadante con cuidado del pellet resultante y vuelva a suspender las células en medio de astrocitos de 1 mL.
- Añadir las suspensiones celulares a los matraces T75 repuestos con 9 mL de medio astrocito (ver 1.2).
- Incubar las células a 37 °C en la incubadora en presencia de 6% v/v de CO2. Después de 4 días, realice el primer cambio completo de medio (10 mL). A partir de entonces, cambie el medio de cultivo cada 2 o 3 días.
- Después de 7 días, compruebe si las células han formado una monocapa confluente. De lo contrario, espere otros 2 a 3 días hasta que se logre la confluencia completa de la cultura><.
NOTA: Los astrocitos muestran cuerpos celulares grandes y aplanados, se localizan en el fondo del matraz y no desarrollan procesos celulares notables. Se diferencian de las pequeñas células progenitoras brillantes de contraste de fase y de la microglía que reside en la parte superior de la monocapa.
- Para deshacerse de las células progenitoras y obtener un cultivo puro de astrocitos, coloque los matraces T75 en un agitador orbital y agite los cultivos O/N a 250 rpm. Asegúrese de que la temperatura esté ajustada a 37 °C y de que el filtro del matraz esté sellado con una película de laboratorio para evitar la evaporación del CO2.
- Al día siguiente, aspire el medio y agregue 10 mL de medio de cultivo fresco repuesto con 20 μM de citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para eliminar las células residuales en división.
NOTA: la incubación con AraC durante 2 - 3 días en la incubadora a 37 °C, un 6% de CO2 dará lugar a un cultivo puro de astrocitos.
- Controle la pureza de los cultivos de astrocitos mediante inspección visual bajo el microscopio óptico. Si las células progenitoras brillantes residuales de contraste de fase y la microglía aún residen en la parte superior de la monocapa astrocítica (ver paso 1.16), repita los pasos 1.18 y 1.19.
NOTA: Las monocapas de astrocitos confluentes y puras pueden mantenerse hasta 14 d en la incubadora (37 °C, 6% v/v CO2) antes de continuar con el siguiente paso. Cambie la mitad del medio cada 3 días. No recoja, congele y descongele los astrocitos, ya que estas células perderán sus propiedades de soporte neuronal a través del procedimiento de almacenamiento.
>2. Preparando los astrocitos para la cocultura indirecta
NOTA: 48 - 72 h antes de preparar las neuronas, transfiera los astrocitos a los insertos de cultivo celular. Generalmente, un solo matraz T75 proporciona un número suficiente de células para soportar los cultivos neuronales obtenidos con una preparación.
- Coloque tantos insertos como sea necesario en placas de 24 pocillos. Cubra cada inserto con 10 μg/mL de PDL (disuelto en agua apta para cultivo celular) durante aproximadamente 1 h a 37 °C, 6% v/v CO2. Después de la incubación, lave los insertos dos veces con PBS. Mientras tanto, proceda con la preparación de los astrocitos.
NOTA: Los insertos llenos de PBS se pueden conservar hasta que la suspensión de células de astrocitos esté lista para su uso.
- Aspire el medio astrocitario (con AraC) y lave el cultivo una vez con 10 mL de PBS para asegurarse de que se elimine cualquier suero residual.
- Añadir 3 mL de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 0,05% a los matraces e incubar las células para la tripsinización a 37 °C, 6% v/v de CO2 durante aproximadamente 10 min.
- Controle el desprendimiento de células mediante inspección visual con un microscopio y facilite el desprendimiento de las células golpeando el lado de los matraces contra el escritorio.
NOTA: Los pasos 2.5 a 2.8 son críticos y deben terminarse dentro de los 15 a 20 minutos.
- Después de la tripsinización, vuelva a suspender suavemente las células en un medio de astrocitos de 7 mL y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL. Centrífuga durante 5 min a 216 x g.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en medio de astrocitos de 1 mL.
- Cuente las celdas usando una cámara de conteo.
- Llene el fondo de los pocillos de la placa de 24 pocillos con 500 μL de medio de astrocitos y transfiera 25.000 células en medio de astrocitos de 500 μL a cada inserto individual. Incubar el cultivo a 37 °C, 6% v/v CO2.
NOTA: Después de 42 - 72 h los cultivos alcanzarán aproximadamente el 100% de confluencia. En esta etapa, la pureza del cultivo se puede verificar mediante inmunocitoquímica. Los cultivos confluentes se pueden mantener hasta 7 días hasta que se proceda al siguiente paso. Cambie la mitad del medio cada 3 días.
>3. Preparación de las neuronas primarias del hipocampo
NOTA: Las neuronas primarias del hipocampo de ratón deben derivarse de embriones E15.5 - E16 de ratones preñados cronometrados.
- Prepare el medio neuronal (MEM con 10 mM de piruvato de sodio, 0,1% p/v de ovoalbúmina, 2% v/v de suplemento de medio B27 y 0,1% v/v de gentamicina (filtrado estéril)), y el medio de preparación (HBSS con 0,6% p/v de glucosa y 10mM HEPES (ácido etansulfónico 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina))). Precalentar y preequilibrar el medio neuronal en matraces filtrantes a 37 °C, 6% v/v CO2.
- Coloque los cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro) en los pocillos de las placas de 24 pocillos (utilice los cubreobjetos especiales, que tienen muescas para el uso con insertos de cultivo celular).
- Cubrir durante al menos 1 h con 15 μg/mL de Poly-DL-Ornitina en agua (grado de cultivo celular) a 37 °C. Utilice al menos 500 μL por pocillo para asegurarse de que los cubreobjetos estén completamente cubiertos. Lave los pozos dos veces con PBS. Deje el PBS en los pocillos hasta que se siembren las celdas. Asegúrese de que los pozos no se sequen.
- Para diseccionar los hipocampos, prepare 3 platos de 10 cm llenos de medio de preparación y 1 tubo de 2 ml con medio de preparación de 1 mL. Prepara unas tijeras y 2 pinzas finas.
- Sacrifique a la rata embarazada por dislocación cervical, esterilice el abdomen lavándolo con etanol al 70% v/v y abra el abdomen con tijeras afiladas. Extraiga el útero con cuentas cuidadosamente con unas tijeras y transfiera el órgano a 1 plato de 10 cm lleno de medio de preparación.
- A continuación, extrae los embriones del útero. Incidir cuidadosamente el útero y extraer el amnios sin dañar los embriones utilizando 2 pinzas. A continuación, decapitar cada embrión con unas tijeras y transferir las cabezas a un segundo plato de 10 cm suministrado con medio de preparación.
- Proceda con la preparación de las cabezas (similar a la preparación descrita en 1.4 - 1.7).
- Inmovilizar la cabeza con un par de pinzas e incidir el cráneo y la piel en la región del cuello cerca del cerebro posterior, perpendicular al eje neural. Use un segundo par de pinzas para levantar el cráneo y la piel que lo cubre, y doble la tapa blanda del cráneo hacia el extremo rostral de la cabeza, exponiendo así el cerebro.
- Con la ayuda de 2 fórceps, separa el cerebro de la cavidad craneal. Para ello, cierre 1 par de pinzas y separe el cerebro del cráneo empezando por los bulbos olfativos y avanzando hacia el cerebro posterior. Recoja los sesos en otro plato de 10 cm lleno de medio de preparación.
- Diseccionar los hipocampos de las partes de la corteza como se describió anteriormente para la preparación de los astrocitos (paso 1.6). Retire los hipocampos de cada hemisferio y recójalos en el tubo de 2 ml lleno de medio de preparación.
- Después de completar la disección, transfiera el tubo al banco de flujo laminar estéril y digiera el tejido del hipocampo con 1 ml de solución de digestión que contenga papaína. Prepare la solución de digestión como se describe en los pasos 1.9 - 1.10, pero use MEM en lugar de DMEM.
NOTA: Los pasos 3.9 a 3.12 son críticos y deben completarse en 10 a 15 minutos.
- Una vez finalizada la digestión, extraiga con cuidado la solución de digestión succionándola suavemente con una pipeta.
- Lave el hipocampo 3 veces con medio neuronal agregando secuencialmente y luego aspirando cuidadosamente 1 mL de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado. No centrifugar la suspensión celular.
- Después del paso de lavado final, triture cuidadosamente el tejido en 1 mL de medio neuronal.
- Cuente las células utilizando una cámara de recuento y coloque 35.000 células en medio neuronal de 500 μL por un solo pocillo de una placa de 24 pocillos (la placa mencionada en 3.2).
NOTA: Opcionalmente, una alícuota celular se puede contrateñir con azul de tripán para evaluar la vitalidad de la preparación celular. Controle la densidad de la placa mediante inspección visual con el microscopio (normalmente de 90 a 110 células por campo visual de un objetivo estándar 10X).
- Coloque las neuronas en la incubadora a 37 °C, 6% v/v CO2 durante 1 h.
- Después de la incubación, saque los insertos preparados (sembrados con monocapas de astrocitos confluentes) de la incubadora (ver paso 2.8). Cambie el medio aspirando el medio de astrocitos y reemplazándolo con medio de neurona fresco de 500 μl.
NOTA: Los insertos deben albergar monocapas de astrocitos confluentes después de 2 - 3 DIV (días in vitro).
- Coloque los insertos con astrocitos cuidadosamente en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas (paso 3.13) utilizando pinzas estériles.
- Vuelva a colocar el cocultivo indirecto neurona-astrocito resultante en la incubadora a 37 °C, 6% v/v CO2.
NOTA: En estas condiciones, las neuronas pueden cultivarse hasta 4 semanas en un medio completamente definido. No es necesario ningún cambio de medio. Para cultivos de larga duración, se recomienda llenar los pozos vacíos con agua estéril para reducir la evaporación de la placa de 24 pocillos.
